叶酸靶向负载索拉非尼的磁性纳米胶束的制备及其在体外对人肝癌细胞的靶向治疗作用

　　索拉非尼是一种靶向作用于丝氨酸/苏氨酸激酶和受体酪氨酸激酶的小分子多靶点抗肿瘤药物(t}，可有效延长晚期肝癌患者的总体生存时间和疾病进展时间，但是索拉非尼不良反应众多，包括手足皮肤反应(HFS}、腹泻、高血压、疲乏、脱发、纳差等，限制了其临床应用。如果能改造索拉非尼的传输体系使其直接作用于肿瘤细胞，必将提高其生物利用率并降低不良反应。因为磁性纳米颗粒可以和生物大分子很容易地结合，所以可以通过在其表面修饰上特异性的配体使其成为很好的靶向性载体5-7Jc〕我们通过制备由叶酸受体介导的、载有索拉非尼的磁性纳米胶束，应用于人肝癌细胞HepG2，探讨其肿瘤细胞靶向性、增殖抑制及促凋亡作用。 　　

　　材料与方法 　　

　　1.材料:无叶酸RPMI1640细胞培养液(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，叶酸(Sigma公司)，索拉非尼(Selleck公司)，SPIO(中山大学高分子研究所)，倒置相差显微镜(德国Leica)，流式细胞仪(BDr,ACSCalibur)，透射电子显微镜(日本JEM-2010)。 　　

　　2.叶酸靶向及非叶酸靶向纳米胶束的制备及表征:以文献报道的方法制备磁性纳米胶束纽8〕，利用开环聚合反应合成烯丙基聚乙二醇聚己内酷共聚物(Allyl-PEG-PCL)，通过水相加成将烯丙基转化为氨基(NH2-PEG-PCL)，用叶酸修饰得到功能化的聚乙二醇聚己内}a共聚物(Fa-PEG-PCL)，然后采用溶剂挥发法制备负载SPIO和索拉非尼的PEG-PCL聚合物胶束，得到叶酸靶向磁性纳米胶束;非叶酸靶向纳米胶束的外壳中未负载叶酸，其余同叶酸靶向胶束的制备纳米胶束的表征包括:粒径、索拉非尼的负载量应用透射电子显微镜测量胶束的粒径，原子吸收法测量胶束的索拉非尼负载量。 　　

　　3细胞培养:本实验中使用人肝癌细胞株HepG2,购自上海爱丁堡生物科技发展有限公司，用含10%胎牛血清的无叶酸RPMI1640培养液，在37℃,5%C0J恒温培养箱进行培养。 　　

　　4.嚓哇蓝(MTT):以每孔5000个HepG2细胞接种到96孔培养皿，培养12h后加人纳米胶束，使靶向与非靶向磁性纳米胶束的索拉非尼终质量浓度均分别为10.0000,5.0000,2.5000,1.2500,0.6250,0.3125Nmol/I，设置调零孔和对照孔，继续培养1h后每孔加人MTT溶液(5g/L)20时，继续孵育4h后吸弃孔内上清液。 　　

　　每孔加150p,1二甲基亚矾(DMSO)，振荡10min。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值。细胞抑制率(%)=(对照组A值一实验组A值)/对照组A值x。 　　

　　5.普鲁士蓝染色:以索拉非尼终质量浓度分别为10.0000,5.0000,2.5000、1.2500,0.62500.3125}A,mol/L的叶酸和非叶酸靶向胶束分别与数量为5x105个的HepG2细胞共孵育1h。之后用4%甲醛固定10min,普鲁士蓝反应液孵育30min，在倒置相差显微镜下观察铁染色状况。体外竞争抑制实验:将HepG2细胞先与游离叶酸(1mmol/T)共孵育30min，再与索拉非尼终质量浓度分别为10.0000,5.0000,2.5000,l.2500,0.6250,0.3125p.,mol/L的叶酸靶向胶束共孵育1h后行普鲁士蓝染色。 　　

　　6.细胞凋亡检测:以索拉非尼终质量浓度分别为10.000,5.000,2.500,1.250,0.625N.,mol/L的叶酸靶向和非叶酸靶向磁性纳米胶束分别与数量为5x105个的HepG2细胞共孵育1h，以未经药物处理的HepG2细胞为空白对照组，1h后收集各组细胞，加人5闪膜联蛋白V一异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)和5闪碘化内锭(PI)，避光室温反应5min，上机用流式细胞仪检测7.统计学方法:应用SPSS16.0统计软件分析，组间细胞抑制率和细胞凋亡率比较采用Student'st检验，各组内的两两比较采用LSD法结果
　　1.叶酸靶向及非叶酸靶向纳米胶束的制备及表征:叶酸靶向及非叶酸靶向的聚合物磁性纳米胶束制备成功，两者的粒径分别为74,80nm，索拉非尼的负载率分为102.2,107.3ml。 　　

　　2.叶酸靶向及非叶酸靶向磁性纳米胶束对HepG2细胞的抑制作用:MTT结果显示，不同索拉非尼浓度的叶酸靶向与非叶酸靶向纳米胶束均能对人肝癌HepG2细胞的增殖产生抑制作用，且药物浓度越高，对细胞增殖的抑制作用越明显;在相同浓度下，叶酸靶向纳米胶束对细胞的抑制作用较非叶酸靶向纳米胶束更强;叶酸靶向药物组对HepG2细胞的总平均抑制率为38.13%，非叶酸靶向药物组的总平均抑制率为22.54%，两者差异有统计学意义(P<0.O5，表1)。 　　

　　3.普鲁士蓝染色:叶酸靶向磁性纳米胶束与
　　HepG2细胞共孵育后，细胞内可见不同量的蓝染颗粒，并随着索拉非尼含量的增加而增加，索拉非尼浓度为10}A,mol/L时，几乎每个细胞内均可见蓝染的铁颗粒;非叶酸靶向胶束与HepG2细胞共孵育后，无论索拉非尼浓度如何，存在蓝色铁颗粒的细胞均很少;体外竞争抑制实验普鲁士蓝染色显示细胞内铁浓度极低。 　　

　　4.细胞凋亡检测:叶酸靶向及非计卜酸靶向磁性纳米胶束的平均细胞凋亡率均较对照组的细胞凋亡率升高，其中叶酸靶向药物组的平均细胞凋亡率为17.O1%，非叶酸靶向药物组为11.04%，而对照组为7.89，叶酸靶向药物组的细胞凋亡率较非叶酸靶向药物组升高更为明显，差异有统计学意义(P<0.05,表2)。 　　

　　讨论
　　Cheng等〔观察到，索拉非尼治疗能够较安慰剂延长晚期肝癌患者中位生存时间，然而平均延长约3个月的中位生存时间仍不尽如人意，提高其疗效必能使肝癌患者进一步受益。另一方面，索拉非尼的不良反应众多，如手足综合征、腹泻、高血压、疲乏、脱发、纳差等。因为这些不良反应，很多肝癌患者不能耐受而不得不减量，甚至停药。基于提高疗效及减少不良反应的需求，寻找一个更有效的索拉非尼靶向传输体系就显得尤为重要。 　　

　　采用聚合物纳米载体来输送药物分子是一个很有效的治疗手段。聚合物纳米胶束能有效地避免网状内皮系统的摄取和肾小管的滤过作用，增加对肿瘤血管的通透性，并且由于肿瘤组织缺乏淋巴排泄毛细管，又有利于渗入的粒子或大分子的滞留，纳米胶束通过增强的渗透和保留效应(EPR效应)渗人和滞留在肿瘤组织内，具有肿瘤组织被动靶向性，易富集在肿瘤组织，是其输送药物的重要特征。叶酸是1种小分子维生素，其受体在许多肿瘤细胞中过度表达，而在正常细胞中表达弱或不表达[}z}。因此「，将u-卜酸连接到聚合物纳米胶束表面，可赋予纳米胶束对肿瘤细胞的主动靶向性，可提高药物在肿瘤组织中的浓度并降低其在正常组织中的浓度，减轻不良反应。 　　

　　本研究中，我们研制了叶酸修饰的负载索拉非尼的磁性纳米胶束，将叶酸受体介导的肿瘤细胞主动靶向性与纳米胶束具有的被动靶向性结合应用于药物传输载体中，增加索拉非尼在肿瘤细胞中的浓度，降低其在正常细胞中的浓度，从而达到减少毒性及增加药效的作用。 　　

　　本研究通过普鲁士蓝染色从体外细胞水平观察叶酸修饰的纳米胶束对HepG2细胞的靶向效应，结果显示，叶酸靶向胶束HepG2细胞共孵育后，胞内可见大量的蓝色铁颗粒，而非叶酸靶向胶束与HepG2细胞共孵育后，存在蓝色铁颗粒的细胞均很少，提示叶酸靶向纳米胶束在体外对人肝癌HepG2细胞具有良好的靶向性;体外竞争抑制实验普鲁士蓝染色显示细胞内铁浓度极低，提示叶酸靶向纳米胶束对HepG2细胞的靶向吸收依赖于叶酸受体。 　　

　　本研究结果显示，叶酸靶向药物组对HepG2细胞的总平均抑制率为38.13%，高于非叶酸靶向药物组的22.54%，两者差异有统计学意义;叶酸靶向药物组的平均细胞凋亡率为17.O1%，高于非叶酸靶向药物组的11.04%，差异有统计一学意义，说明在体外细胞水平上，叶酸靶向纳米胶束对人肝癌细胞HepG2具有明显的增殖抑制及促凋亡作用。 　　

　　参考文献 　　

　　Wilhelm SM,Carter C,Tang L. BAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway.and receptor tyrosine kinases involved in tumor progession and angiogenesis[J].Cancer Research,2004.7099-7109.
　　Abou-Alfa GK,Schwaaz L,Ricci S. Phase Ⅱ study of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma[J].Journal of Clinical Oncology,2006.4293-4300.
　　Hampton T. Cancer drug trials show modest benefit:drugs target liver,gastric,head and neck cancers[J].Journal of the American Medical Association,2007.273-275.
　　Zavaglia C,Airoldi A,Mancuso A. Adverse events affect sorafenib efficacy in patients with recurrent hepatocellular carcinoma after liver transplantation:experience at a single center and review of the literature[J].European Journal of Gastroenterology and Hepatology,2013.180-186.
　　Gupta AK,Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications[J].Biomaterials,2005.3995-4021.
　　黄广建,曹宏明,武春涛. 新型铁碳复合磁性载体的制备及其物理生物学表征[J].中华实验外科杂志,2006,(4):545-547.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.04.011.
　　孙璇,孙凯,曹正国. 葡聚糖磁性纳米颗粒在基因转染人树突状细胞中的研究[J].中华实验外科杂志,2005,(9):1113-1115.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.09.034.
　　Hong GB,Yuan RX,Liang BL. Folate-functionalized polymeric micelle as hepatic carcinoma-targeted,MRI-ultrasensitive delivery system of antitumor drugs[J].Biomedical Microdevices,2008.693-700.