μCellect-新型的噬菌体展示平台

噬菌体展示技术是一种被广泛使用的抗体发现技术，在抗体发现过程中，噬菌体抗体库的筛选是为关键的环节之一，将文库内的噬菌体与靶标孵育，未结合的噬菌体，扩增结合的噬菌体，得到具有亲和力和特异性的克隆组成的亚库，再从中筛选单个克隆，并转化为IgG形式，用于诊断或治疗试剂。

目前广泛使用的筛选方法有很多，但是传统的筛选技术也存在着很多局限性，例如筛选周期长，筛选得到的抗体特异性以及亲和力不够高等问题。 针对这些问题，David N. Philpott等人提出了μCellect方法，该方法使用的是一种低成本（<50美元/芯片）、高通量(>107cells/h)的细胞分选器（MICS)，原始噬菌体文库与少数表达目标抗原的细胞和大量缺乏目标抗原的细胞共同孵育后，用捕获探针所特有的磁性纳米颗粒(MNPs)标记目标细胞，目标细胞通过一组倾斜的导向器进行横向偏转，以平衡Stokes的阻力（来自流体流动）和磁力（来自MNPs）。继而开始进行分选。洗脱目标细胞得到噬菌体，并扩增得到噬菌体亚库，重复这个过程进行迭代富集，并且将所有的子库进行NGS测序。为验证该方法的适用性，本文介绍了以针对Wnt信号通路中的关键配体人Frizzled-7的抗体筛选的过程以及结果。 

1、微流控细胞分选（MICS)平台试验

该试验使用带有GFP内部的外源性myc标签以区分共表达人Fzd7的目标细胞和阴性细胞，使用MICS设备分选之后，发现超过90%的myc+细胞被捕获，结果表明噬菌体结合对细胞捕获的影响小，之后，为了检测可在MICS装置上分辨出阳性细胞和阴性细胞的比例，将目标细胞加入到非抗原表达的细胞中，并对样本进行标记和分类，发现在靶细胞与非靶细胞的比例为1：200时，细胞几乎都被回收了，通过比较不同比例下细胞的分选效果，因此选择了1：20的比例来进行筛选。使用与噬菌体展示应用程序相关的指标，将MICS平台的性能与其他技术进行了对比测试。发现磁激活细胞分选(MACS)具有与MICS相当的通量，但结合的噬菌体在分选过程中会丢失，荧光激活细胞分选(FACS)具有与MICS相似的噬菌体回收率，但处理大细胞群时的速度很缓慢。

4、克隆的验证

将筛选获得的候选CDR序列还原为IgG1形式，并进行表达、纯化和定量。评估候选克隆结合Fzd7+myc+和myc+细胞的能力。同时将野生型CHO细胞作为非特异性结合的对照。采用OMP18R5(IgG2形式)作为阳性对照。结果显示三种候选克隆(ML7、ML8和ML9)对Fzd7+myc+靶细胞系表现出高特异的亲和力。其他候选克隆对靶细胞系的亲和力低。结果表明，k-means算法得分高低比分群大小更能决定候选克隆的亲和力。对ML7、ML8和ML9进行的分析显示，ML9的EC50值和对Fzd7的解离常数(Kd)都与OMP18R5相当，且ML7、ML8和ML9对Fzd7的亲和力均在皮摩尔范围内(ML7,448±53pM；ML8,4.98±0.28nM；ML9,292±66pM；OMP18R5,236±50pM)。为了检测候选克隆是否能结合到内源性的人Fzd7细胞，我们以Fzd7的CRISPRKO的HEK293T细胞系作为阴性细胞对照。对一组Fzd7低表达的人细胞系进行了流式细胞术。

4. 候选抗体的验证

试验为了评估ML7对候选蛋白的特异性，使用了所有Frizzled蛋白(不包括Fzd3)进行ELISA检测。结果显示，ML7对Fzd1/2/7均有亲和力，但对Fzd5/8的亲和力很低。表明ML7具有特异的结合能力。为了进一步比较结合物，我们使用流式细胞仪阻断试验进行了初步的表位结合分析。结果显示所有组合均有阻断作用，但当OMP18R5为阻断剂时，效果差。这些结合情况的差异可能具有临床相关性，因为OMP18R5的临床试验由于骨相关不良事件而停止，而Fzd8是已知的骨重塑调节因子。结果显示，ML7对Fzd7具有更高水平的特异性，这可能有利于临床开发应用。