结直肠癌的肠道菌群特征和病原真菌

肠道菌群是人体肠道微生物群的重要组成部分，但其在结直肠癌(CRC)中的作用仍不明确。我们进行了一项荟萃分析，以揭示真菌菌群对CRC的贡献。   

方法：

并建立了一个额外的内部队列，共计1329个宏基因组(454个CRC、350个腺瘤和525个健康受试者)。分析了真菌菌群组成和微生物相互作用。候选CRC富集真菌物种(Aspergillus rambellii)在体外和体内进行了功能验证。   

结果：

多队列分析显示CRC患者肠道菌群发生了改变。我们从多个队列中确定了与CRC和腺瘤患者相关的真菌。标志性CRC相关真菌包括6种富集真菌(Aspergillus rambellii、Cordyceps sp. RAO-2017、Erysiphe pulchra、Moniliophthora perniciosa、Sphaerulina musiva和Phytophthora capsici)和1种减少物种(Aspergillus kawachii)。

与腺瘤和健康受试者相比，CRC富集真菌之间的共现相互作用在CRC中变得更强。

此外，我们报道了CRC进展过程中肠道真菌和细菌之间的跨界相互作用，其中A. rambellii与CRC富集细菌具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)密切相关。

A. rambellii促进体外CRC细胞生长和异种移植小鼠的肿瘤生长。我们进一步发现，真菌和细菌联合生物标志物比纯细菌组更准确地区分CRC患者和健康受试者(AUC相对变化增加1.44%-10.60%)。  

结论：

本研究揭示了结直肠肿瘤发生阶段的肠道菌群特征和病原真菌。除细菌外，粪便真菌还可用于CRC患者的无创诊断。

结果

共有1329名受试者被纳入CRC进展的肠道菌群荟萃分析

在这项荟萃分析中，我们纳入了8项已发表的研究，这些研究使用鸟枪法宏基因组学来表征CRC患者与健康受试者的粪便微生物群(表S1和S2)。

我们还建立了一个内部粪便宏基因组数据作为额外的研究群体(表S1和S2)。在这些宏基因组中，中位数为0.16%(10-2.80)的总宏基因组reads被映射到真菌基因组，这与之前的研究一致(0.1%)。

稀疏曲线显示，所有队列样本在真菌测序reads达到10,000时均达到平台状态。为了确保样品质量，我们采用了一系列严格标准的过滤来去除污染或真菌含量低的样品。

Hanningan等人的队列进行了PCR预处理，并且测序深度较低，因此该数据集被丢弃以避免后续分析中的扩增偏差。

过滤后，共保留了1329个宏基因组，包括454名健康受试者(占检索到的健康宏基因组总数的68%)、350名腺瘤患者(占检索到的腺瘤宏基因组总数的73%)和525名CRC患者(占检索到的CRC宏基因组总数的68%)。

CRC、腺瘤和健康受试者的丢弃样本没有差异，表明我们的样本均匀分布在不同的研究对象组中。

丢弃样本均匀分布在不同的研究对象组中(χ2 =4.03，p = 0.13；卡方检验)。 

肠道菌群在CRC进展中发生改变 

首先研究了门水平的真菌组成。在所有队列中，子囊菌门(Ascomycota)是CRC患者和健康受试者中普遍的真菌门。然后，我们比较了CRC患者和健康受试者之间前5个门的丰度，发现这些门在所有队列中都没有一致的丰度变化。

对于真菌丰富度，我们发现将所有队列组合在一起时，CRC患者的α多样性(chao1指数)降低，这与之前的报告一致(p<0.05)。而仅在三个队列中观察到α多样性的差异，表明存在队列间变异。

使用主坐标分析(PCoA)，我们发现各队列间真菌群落的变化归因于人群(洲或性别)和疾病阶段(CRC、腺瘤或健康)的差异，与之前的研究一致。

体重指数(BMI)和肿瘤部位对真菌群落变化没有影响。总体而言，我们证实了肠道真菌菌群与CRC的关联。

确定CRC和腺瘤中的标志性真菌种类 

为了表征CRC相关真菌，将所有CRC患者中相对丰度>0.1%(n=296)的单个真菌丰度与健康受试者进行了比较。在FDR<0.1时，我们确定了74种真菌物种，其丰度存在差异，然后在FDR<0.01时，我们将其缩减为入围的33种(下文称为真菌核心组)(Wilcoxon秩和检验)。

该核心组由与CRC相关的具有不同丰度的物种组成，其中Aspergillus rambellii是丰富的，而Aspergillus kawachii少。每个真菌物种的丰度变化在队列间差异很大，因此表明存在队列间差异。

我们进一步评估了队列异质性和潜在混杂因素对单个真菌物种的影响。与我们的PCoA分析一致，队列异质性比其他因素(年龄、BMI和性别)的影响更大。

值得注意的是，与队列异质性和其他混杂因素相比，疾病阶段(CRC、腺瘤或健康)与33个物种的真菌核心组丰度的变化更密切相关，表明疾病阶段对物种组成的影响大于队列间变异。 

真菌核心组包括10种CRC富集真菌和23种CRC减少真菌。与健康受试者相比，CRC患者的A. rambelli丰度增加3.0倍，A. kawachii丰度减少2.0倍(p<0.0001)。

与健康受试者相比，CRC患者中A. rambelli的中位丰度更高，并且这种增加在8个队列中的7个队列中持续。

为了确定在不同队列中一致变化的真菌，我们识别了8个队列中至少在7个队列中发生变化的18种真菌(7种CRC富集，11种CRC减少)。此外，在真菌核心组中，从CRC前体、早期CRC到晚期CRC，发现了2种真菌(Cordyceps sp. RAO-2017和Phytopythium vexans)且一致的富集，1种真菌(A. kawachii)减少，表明这些真菌物种在CRC进展中的因果作用。 然后将CRC患者与腺瘤患者的真菌丰度进行比较。

FDR<0.01时，在CRC和腺瘤患者之间发现了24种差异丰度真菌。

在这24种真菌中，观察到1种CRC富集(A. rambellii)和6种CRC减少的真菌物种(A. kawachii、Fusarium pseudograminearum、Lentinula edodes、Hanseniaspora guilliermondii、Saitoella complicata和Cryptococcus neoformans)的丰度变化是腺瘤患者的1.4倍以上。

值得注意的是，当将CRC患者与腺瘤患者和健康受试者进行比较时，7种真菌的丰度发生了一致的改变，这表明它们是CRC腺瘤相关真菌的标志性物种。这7种真菌包括6种CRC富集真菌

我们进一步比较了腺瘤患者和健康受试者之间的真菌丰度。FDP<0.01时，在腺瘤患者和健康受试者之间发现了10种差异丰度真菌。

在这10种真菌中，腺瘤患者中5种真菌的丰度至少增加了1.5倍。

当CRC患者与健康受试者比较时，这5种真菌未被纳入核心组，表明这5种真菌仅与腺瘤相关，而与CRC无关。

总之，我们的多队列宏基因组分析揭示了与CRC和腺瘤相关的标志性真菌物种。

多队列分析报告了一组与CRC密切相关的肠道真菌。

CRC患者与健康受试者的特征真菌种类比较

(A)真菌核心组包括10种CRC富集真菌和23种CRC减少真菌物种，其在CRC患者(n=454)、腺瘤患者(n=350)和健康受试者(n=525)之间的丰度存在差异。真菌丰度归一化为相对于对照样品丰度中值的自然对数倍数变化。临床和队列信息显示在图顶部，包括队列、性别、年龄、肿瘤位置和BMI。

(B, C)所有队列(B)和每个研究(C)中倍数变化大的两种真菌A. rambellii(CRC富集)和A. kawachii(CRC减少)的小提琴图。健康受试者和CRC患者分别用黄色和红色表示。 

Aspergillus rambellii在体外和异种移植小鼠模型中促进CRC

为了验证计算机实验结果，将两种