新研究或有助于开发靶向γ-分泌酶药物

抑制γ-分泌酶活性策略显示严重副作用

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γ-分泌酶复合物可切割多种I型跨膜蛋白，以淀粉样前体蛋白(APP)和Notch蛋白为例。APP被β-分泌酶切割产生羧基端99残基片段，称为APP- C99，然后被γ-分泌酶连续切割，释放出不同长度的APP胞内结构域(AICD)和β-淀粉样肽(Aβ)。相对较长的Aβ容易在大脑中形成低聚物和淀粉样斑块。

淀粉样斑块的积累是AD的一个标志。抑制γ-分泌酶活性已被用于AD的治疗。然而，到目前为止，这一策略尚未显示出益处；更糟糕的是，在临床试验中观察到严重的副作用。副作用可能部分归因于非特异性抑制γ-分泌酶对其他底物的切割，特别是Notch，它在发育和细胞命运的决定中起着至关重要的作用。在Notch上选择性抑制APP的γ-分泌酶切割被认为可以减轻副作用。然而，APP和Notch以类似的方式结合γ-分泌酶，使底物选择性γ-分泌酶抑制剂(GSIs)的设计复杂化。

MRK-560与PS1之间存在优先关联

02

MRK-560 是一种用于 PS1 和 PS2 的同种型选择性抑制剂，为了验证MRK-560的抑制作用，研究团队使用纯化的PS1或PS2复合物重建了体外裂解测定。Aβ40（不同长度的 Aβs 中的主要裂解产物）和 AICD（其裂解反映了γ分泌酶的内肽酶活性）的产生分别用 AlphaLISA 和蛋白质印迹进行测量。

与先前的研究一致，MRK-560显示出对PS1复合物的更有效抑制。集成电路PS1或PS2复合物的MRK-560估计分别为33±2 nM或173±24 nM。在200 nM MRK-560存在下，PS1复合物产生的AICD被完全抑制。相比之下，即使在存在10μM MRK-560的情况下，PS2复合物产生的AICD仍然可以检测到。

在MRK-560结合时，与无配体状态相比，PS1经历了实质性的构象变化。与其他报告的 GSI 类似MRK-560结合诱导两条β的形成和PAL环的运动。TM6之后的胞质序列折叠到TM6a，TM6a通过柔性连接子连接到TM6并向抑制剂结合位点弯曲。PS2M采用与apo复合物几乎相同的构象，缺乏抗平行β片和TM6a的延伸特征。平行结构分析表明，与PS2相比，MRK-560与PS1之间存在优先关联。

接下来，研究人员检查了结构以确定MRK-560同种型选择性的分子基础。MRK-560与PS1的Asp385，Leu432和Leu282形成三个氢键（H键）。其中，Asp385是PS1的催化残基之一，Leu432先于PAL基序，Leu282位于PS1的TM6a和β1之间的中间回路。MRK-560的二氟苄基（DFB）和三氟甲磺酰胺（TFMS）基团与Val272，Thr281，Lys380，Gly382，Ala431和Pro433相互作用，氯苯基（CP）基团与Val379，Leu381，Leu418，Thr421，Leu422和Ala434的侧链相互作用。

为了研究这两个残基是否负责对MRK-560的亚型依赖性敏感性，研究人员生成了PS1和PS2变体，在这两个位置交换了残基，并检查了它们对MRK-560抑制的反应。共生成了六个变体，包括PS1中的Thr281 / Leu282与PS2中的Pro287 / Ile288的单残差交换和双残留物交换。在体外裂解测定中检查MRK-560对六种含有PS1 / PS2突变体的复合物的反应，每种复合物纯化至均一性。

03

研究表明，MRK-560会减少大脑中Aβ的产生。重要的是，它不会在野生型小鼠模型中诱发Notch相关的副作用。在这项工作中，研究人员测定了MRK-560处理过的PS1/PS2复合物的冷冻电镜结构，以阐明MRK-560亚型特异性的分子基础。

MRK-560占据PS1的底物结合位点，但在PS2中不可见。结构比较发现，PS1中的Thr281和Leu282是MRK-560亚型依赖性敏感性的决定因素，PS1和PS2之间的交换实验证实了这一点。通过揭示早老素的亚型选择性抑制机制，该研究工作可能有助于未来靶向γ-分泌酶的药物的发现。