一种应用于胎儿染色体非整倍体诊断的28重QF-PCR新方法

目的
建立一种检测胎儿染色体非整倍体的28重QF-PCR新方法，评估该方法的临床适用性。

方法
选取13号染色体上6个位点，18号染色体上6个位点，21号染色体上7个位点，X染色体上3个位点，Y染色体上1个位点和SRY，X和Y染色体共有2个位点和AMEL，位于3号染色体与X染色体的TAF9b共28个基因座，设计引物建立一管28重QF-PCR新方法。收集316例健康人群外周血样本对该方法进行杂合度和适用性评估。收集456例经核型分析的临床羊水样本进行该方法验证，分析总符合率、特异性和敏感性。

结论
本研究开发的一管28重QF-PCR新方法是一种能够准确检出胎儿染色体非整倍体的非常有效鉴定方法。

出生缺陷是一种先天性形态结构、生理功能或代谢异常所致的疾病。据报道，每200个新生儿中就有1个发生出生缺陷[1]。其中在产前检测到的染色体异常中染色体21/18/13/X/Y异常占比>80%[2]。迄今为止，只能通过产前筛查或诊断的方式来减少或避免出生缺陷。

产前胎儿染色体非整倍体检测主要通过核型分析或其他分子学方法进行。核型分析作为染色体分析的金标准，需要进行细胞培养，费时费力。QF-PCR方法已被证明是一种非常有效的鉴定方法[3]。根据2016年发布的《QF-PCR技术在产前诊断中的应用专家共识》[4]，通过QF-PCR技术可以诊断出99.2%~100.0%的21、18、13、X和Y等染色体非整倍体异常，还可以检出三倍体和母源污染。具有经济、快速得出结果等优点，更适合于临床检测的推广应用。

目前市场上基于QF-PCR技术检测该5种染色体异常并通过NMPA批准的商品化试剂盒只有达瑞生物的“染色体（13/18/21/X/Y）多重STR基因分型试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）”。该试剂盒选用20个STR位点对该5种染色体非整倍体进行判断，但仍有部分样本因无法有效判读。另外，该试剂盒在PCR阶段分3管进行，既导致成本增加也耗时耗力。因此本研究将开发出一种一管多重QF-PCR新方法检测胎儿染色体非整倍体，弥补原产品的不足，为临床提供参考依据。

01、对象与方法

1.1 研究对象

（1）316例健康人群外周血样本于2019年7月至2020年6月从达瑞医学检验(广州)有限公司收集。

（2）456例16~22周的孕妇羊水样本于2020年9月至2021年5月从东莞市妇幼保健院和广州妇女儿童医院收集。

1.2  主要仪器与试剂

干式恒温器；2720 PCR扩增仪；3500Dx基因分析仪；NANODROP 2000；核酸提取或纯化试剂盒和染色体（13/18/21/X/Y）多重STR基因分型试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）（广州市达瑞生物技术股份有限公司）（注：20重QF-PCR法）；10×PCR Buffer；TaKaRa Taq HS；dNTP；引物合成；GeneScanTM 600 LIZ® Size standard v2.0；ABI Hi-Di™ formamide等。

1.3 方法

1.3.1  染色体核型分析

按细胞遗传学实验室常规进行培养和制片。

1.3.2  荧光定量PCR技术( QF-PCR）

（1）DNA 提取

按照试剂盒说明书抽提羊水和外周血基因组DNA。

（2）引物设计

28个位点引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）PCR反应体系及条件

总体积25 μL，其中DNA 20~80 ng， dNTP 0.4 µL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）3.5 µL，引物各100 pmol，TaKaRa Taq HS 1 µL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃ 延伸50 s，共25个循环；72℃延伸10 min。

（4）毛细管电泳和片段分析

取1 μL PCR产物和13.5 μL甲酰胺、0.5 μL GeneScanTM 600 LIZ® Size standard v2.0（内标）混合。95℃变性5 min，在ABI 3500 Dx 基因分析仪和Gene mapper 4.1进行片段分析。

1.3.3统计分析

1.3.3.1 健康人群的杂合度计算

单个STR位点杂合度计算

K代表单个STR位点杂合度；R代表单个STR位点出现双峰或三峰的样本数；Z代表总样本数；

1.3.3.2 STR位点组合模式的适用性评估

（1）对13三体、18三体、21三体、XXX染色体型别判读标准为相对应的染色体上至少2个STR位点出现三峰或双峰比值符合1:2或2:1的情况可判别相应染色体为三体型别，因此STR位点组合模式对13三体、18三体、21三体、

（2）对XXY染色体型别判读则为确定含Y染色体的情况下，至少1个位点出现双峰且比值符合1:1的情况，因此STR位点组合模式对XXY染色体非整倍体

P代表适用性，代表第个STR位点；代表每条染色体的STR位点总数；N代表第个STR位点杂合度；

代表第个STR位点的纯合概率。

1.3.3.3 临床羊水样本的总符合率、灵敏度和特异度计算

根据表2，计算28重QF-OCR新方法的结果和染色体核型分析结果对比的总符合率、灵敏度和特异度。

表2 临床羊水样本结果的统计方法

具体计算公式如下：

02、结果

2.1 28重QF-PCR新方法与原试剂盒的位点信息对比

在原试剂盒20重QF-PCR法的基础上，28重QF-PCR新方法分别在13号染色体增加了D13S317、D13S325，18号染色体上增加了D18S390、D18S978、D18S499；21号染色体增加了D21S1437、D21S1435、D21S11；X染色体上增加了HPRTB，Y染色体上增加了DYS448，还增加了X和Y染色体共有的DXYS218、DXYS267及3号染色体和X染色体共有的TAF9b位点，具体见表3。

2.2 STR位点杂合度和检测的适用性评估

13号染色体6个位点的杂合度分布范围为0.70~0.87；18号染色体7个位点杂合度分布范围0.57~0.86；21号染色体9个位点的杂合度分布范围0.63~0.86；X染色体上7个位点的杂合度分布范围0.56~0.88，具体见表3。

计算28重QF-PCR新方法在检测13三体、18三体、21三体、XXX、XXY的适用性P值分别为99.9%、99.3%、99.9%、96.0%、99.7%；而原试剂盒20重QF-PCR法的适用性则为97.4%、95.2%、99.8%、96.4%、99.8%。因纳入统计的男性样本较少，本研究未对Y染色体位点进行统计。

2.3 临床羊水样本的阳性符合率和灵敏度，阴性符合率和特异度分析

根据统计结果（表4）计算，28重QF-PCR新方法与染色体核型分析结果相比，总符合率、灵敏度和特异度。

4、28重QF-PCR新方法检测结果与染色体核型结果样本数统计

2.4 原试剂盒未检出的临床样本适用性评估

对原试剂盒20重QF-PCR方法检测无法判断的14例羊水样本，其中1例13三体阳性，1例18三体阳性，12例正常样本，28重QF-PCR新方法均能够检出，结果与核型分析检测结果一致。

03、讨论

本研究开发了一种一管28重基于STR分型的快速、经济的胎儿染色体非整倍体检测方法。该方法通过一管PCR反应进行，与原试剂盒三管法相比进一步节省了试剂成本和操作时。

通过316例健康人群的位点杂合度调查显示，一管28重QF-PCR新方法，与原20重三管法相比，增加的21号染色体D21S1437、D21S1435和D21S11位点的杂合度分别为0.63、0.76、0.78，Zhu等[5]报道使用包含了D21S1437、D21S1435和D21S11共11个位点应用于唐氏综合征检测，针对740例无关样本判断杂合度，得出该3个位点杂合度分别为70.4%、76.5%、81.4%，与本研究结果相类似。

18号染色体增加的D18S390、D18S978、D18S499位点杂合度分别为0.57