环化ADP核糖异构体的生成、化学结构与免疫信号传递

细菌、动物和植物等有机体必须防御自身以抵抗病原体，这些有机体的免疫信号通路中存在着同源的蛋白基序，TIR（Toll/interleukin-1 receptor）结构域则是代表性的一种。TIR结构域包含约150个氨基酸，广泛分布于动物、植物和细菌中，并通过自蒂合或与其它同型TIR结构域相互作用发挥功能1。在植物和动物中，这些结构域主要存在于具有免疫功能的蛋白中，如Toll样受体（TLRs）、白细胞介素1受体（IL-1Rs）以及它们的衔接蛋白，另外还存在于植物核苷酸结合的富亮氨酸重复受体（NLRs）中2-4。TIR结构域形成高度规则寡聚体，并通过SCAF系统进行信号放大3,5。而在细菌中，包含TIR结构域的蛋白在抗噬菌体防御系统及宿主免疫抑制中具有十分重要的作用。

TIR结构域具有水解切割烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的酶催化活性6。如动物中SARM1的TIR结构域可以通过切割NAD+形成烟酰胺和腺苷二磷酸核糖（ADPR）或环ADPR（cADPR）从而执行程序性轴突死亡6。相似地，植物NLRs的TIR结构域可以切割NAD+形成烟酰胺和ADPR或cADPR异构体v-cADPR7。二者的催化活性都需要一个保守的谷氨酸残基6,7。细菌的TIR结构域同样可以水解切割NAD+形成烟酰胺和ADPR或不同的cADPR异构体v-cADPR或v2-cADPR，且TIR结构域的这种NADase活性是细菌抗噬菌体感染的Thoeris系统中的关键组分8,9。

在以往的研究中，动物SARM1和植物NLRs的TIR结构域的结构和功能机制已被成功揭示。然而，关于细菌中TIR结构域的结构和功能鉴定仍然缺少。

为了鉴定cADPR异构体的环化位点，研究者表达并纯化了来自鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii AbTir蛋白（AbTirTIR）和海水杆菌Aquimarina amphilecti AaTir蛋白（AaTirTIR）的TIR结构域，它们分别可以催化生成v-cADPR和v2-cADPR。基于实时核磁（NMR）和荧光的NADase分析证实AbTirTIR和AaTirTIR具有生成cADPR异构体的酶催化活性，并且AbTirTIR产生的v-cADPR与植物免疫受体L6和ROQ1的TIR结构域产生的cADPR异构体相同。随后，研究者利用高效液相色谱纯化出两种cADPR异构体，并通过NMR确定了它们的化学结构，结果表明AbTirTIR催化ADPR形成(1’’→2’) O-糖苷键，而AaTirTIR催化ADPR形成(1’’→3’) O-糖苷键。

与SARM1和植物TIR结构域相似，产生cADPR异构体的细菌TIR结构域同样需要自蒂合发挥NADase活性。为了确认这一过程的分子基础，研究者解析了AbTirTIR以及一种相近的可产生v-cADPR的多行类杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）BtTirTIR的晶体结构，分辨率分别为2.16 Å和1.42 Å。二者的结构非常相似，并且与已报道的产生v-cADPR的PdTirTIR和TcpBTIR相近，但与ThsB TIR结构域相似性较低。在已报道的TIR结构域结构中，保守的谷氨酸残基位于由βA片层、AA和BB loops、αB和αC螺旋共同形成的口袋中，而在AbTirTIR和BtTirTIR中，αB和αC螺旋具有不同的构象，从而使对应的谷氨酸（E208和E230）暴露在表面，同时其周围区域柔性较高，因此这些结构处于失活构象状态。

为了捕获AbTirTIR的活性状态，研究者使用了生物化学稳定性更高的NAD+水解碱基交换产物8-氨基喹啉（3AD）以抵抗酶切割，并通过冷冻电镜解析了AbTirTIR:3AD纤维丝的结构。结构显示3AD位于AbTirTIR单体之间，且TIR结构域的排列不同于以往报道的酶组装形式，而是与TLR衔接蛋白MAL和MyD88的支架组装方式相似，由两条平行的链头尾相接。链内的BE界面包含BB-loop，而链间BCD界面包含一个分子和平行链上互作的两个分子。组装过程伴随着BB-loop及αB和αC螺旋的构象变化，其中BB-loop和αB分别向外倾斜约50°-55°，而αC重新折叠并囊入了CC和CD loops的残基由于通过相似的BE进行排列，AbTirTIR活性位点以及3AD分子构象均与SARM1TIR相似。研究者进一步通过点突变分析验证了活性位点区域及链间和链内界面残基对于AbTirTIR的NADase活性的重要性。

同时，研究者还分析了这些突变体的NADase反应产物，结果只有W204A突变体v-cADPR产量下降，表明W204对于ADPR环化至关重要。进一步的序列比对显示生成cADPR的TIR结构域中，W204对应的残基均为芳香族氨基酸，表明这一位点的大芳香族氨基酸促进了cADPR生成，所有环化酶活性TIR结构域此位点均为芳香族氨基酸。点突变分析同样证明了该位点的芳香族氨基酸对于cADPR产物生成的必要性。

由于细菌ThsB或植物TIR结构域催化生成的cADPR异构体可以激活假炭疽杆菌（B. cereus）Thoeris抗噬菌体防御系统的ThsA NADase活性，研究者对本研究纯化获得的cADPR异构体是否可直接激活ThsA进行了检验。研究者首先纯化了四种ThsA蛋白，并通过NMR测定了它们在不同ADPR存在条件下的NADase活性。结果显示，v2-cADPR以剂量依赖性激活来自屎肠球菌（Enterococcus faecium）的EfThsA和来自马链球菌（Streptococcus equi）的SeThsA，低活化浓度可至5 μM，而v-cADPR则只在实验高浓度500 μM时活化二者，此外ADPR和cADPR则不能激活二者的NADase活性。通过ITC测定，v2-cADPR以1:1摩尔比直接结合失活（EfThsA）和自激活（AbThsA）形式的ThsA，Kd值分别为59.1±15.8 nM和189±1.6 nM，而v-cADPR与ThsA则未检测到结合。

为了清楚ThsA结合cADPR异构体的选择性，研究者解析了假炭疽杆菌中BcThsA的SLOG结构域与v2-cADPR复合物的晶体结构，分辨率为1.6 Å。结构中可以观察到具有（1’’→3’）O-糖苷键的cADPR异构体连续电子密度，证实了前面的NMR分析结果。BcThsASLOG在溶液中形成稳定的二聚体，在晶体中形成对称的二聚体，并且具有与未结合配体的BcThsA结构相同的二聚界面。v2-cADPR结合至对称二聚体界面相邻的高度保守口袋中，且两个分子中的两个腺嘌呤碱基间距4.5 Å并通过两个水分子桥接。同时，v2-cADPR的不同基团还可以与结合口袋中的多个氨基酸形成一系列氢键相互作用，从而稳定其与ThsA的结合。而v-cADPR的（1’’→2’）O-糖苷键则不能形成一个关键的氢键，并且它的腺苷基团也可能会与结合口袋中的氨基酸残基形成空间位阻，从而解释了ThsA对v2-cADPR的倾向性。

随后，为了揭示v2-cADPR激活ThsA更具体的分子机制细节，研究者又解析了未结合配体的失活状态SeThsA的晶体结构，分辨率为3.4 Å，并比较了它与自活化BcThsA（PDB ID：6LHX）以及前面解析的BcThsASLOG:v2-cADPR复合物晶体结构。晶体堆积分析显示，SeThsA是一个D2对称的四聚体，核心由两个SIR2二聚体组成，且两侧包含了两个SLOG二聚体。自活化BcThsA具有相同的四聚体构造，但SIR2: SIR2界面存在差异。相比于SeThsA SIR2二聚体，BcThsA SIR2二聚体中的一个分子转动了~27°并移位~14 Å，从而导致互作界面面积减小。同时，SeThsA中参与SIR2二聚化且遮蔽部分预测活性