肿瘤溯源早筛新方案 —— 一种高效经济的甲基化测序方法

游离 DNA（cfDNA）检测作为新型的液体活检的重要组成部分，对于肿瘤的诊断、分子分型、疗效评估和复发预后监测等领域具有广泛前景，其中 cfDNA 甲基化已被证明可应用于肿瘤早期诊断和器官溯源，具有重要的临床应用价值。但当前 cfDNA 检测在肿瘤早期诊断方面仍存在局限性：主要包括早期患者的肿瘤 cfDNA 的丰度低、不同癌种 cfDNA 分子异质性特征、受到样本量的限制无法反映泛癌种患者疾病特征的多样性等。

为了应对肿瘤 cfDNA 丰度低的挑战，通过甲基组检测可以分析尽可能多的 cfDNA 片段，克服肿瘤的分子异质性特征，降低假阴性的概率， 同时，该技术方法更经济、高效 。通过开发了一套 cfDNA 全基因组甲基化测序（cfMethyl-Seq）的集成实验和计算系统，通过提取四种类型肿瘤的 cfDNA 甲基化特征的计算方法，在具有价格优势的情况下能够准确的进行癌症检测和定位。因此，该检测方法在泛肿瘤早期诊断和溯源方面具有巨大潜能。

试验方法

通过对 408 名患者的 cfDNA 样本进行了甲基化分析检测，其中包括 217 名结肠癌、肝癌、肺癌或胃癌患者，以及 191 名非癌症患者（包括各种其他疾病患者）。提取四种类型的 cfDNA 甲基化特征（癌症 / 组织特异性高甲基化和低甲基化标志物），并进行检测和定位癌症的集成学习，对单一标志物和集成模型在不同癌种中诊断、肿瘤溯源能力进行验证。

主要实验结果

01 高成本效益 cfDNA 甲基化组测序（cfMethyl-Seq）

方法

为了能够克服传统亚硫酸氢盐测序（RRBS）只对完整基因组 DNA 上的 CpG 岛甲基化富集区域的局限，研究者开发了 cfMethyl-Seq 技术，仅需对富含 CpG 的区域进行甲基化分析，实现以更低的成本对 cfDNA 全基因组甲基化的测序，研究者发现，基于 cfDNA 构建的 cfMethyl-Seq 文库显示特征条带的长度分别为 68bp，135bp 和 203bp。通过将 cfMethyl-Seq 文库和 cfDNA 全基因组测序（WGBS）文库以及在实体组织上的传统 RRBS 文库进行了比较，发现来自 CpG 岛、shore 和 shelf 区域的 cfMethyl-Seq 读数分别为 34.11%、12.38% 和 13.14%，而传统 RRBS 读数分别为 33.65%、13.35% 和 14.04%。其中在 CpG 岛的 cfMethyl-Seq 的富集程度是 WGBS（2.66%）的 12.8 倍。在同一实体组织的传统 RRBS 文库比较表明 cfMethyl-Seq 依旧获得相似的甲基化水平，且剪切的 cfDNA 与完整基因组 DNA 上的甲基化水平的呈相关。

02 模型对于肿瘤诊断的性能评估

研究者团队首先通过 RRBS 数据分析确定了实体瘤和邻近正常组织之间存在差异的癌症特异性标记物，经过 10 次运算平均获得了 23，748 个癌症特异性高甲基化标记和 28，197 个癌症特异性低甲基化标记用于癌症检测。然后利用患者 cfDNA 样本的 cfMethyl-Seq 数据，根据甲基化模式对四种肿瘤/特定组织甲基特征的读数进行去卷积化从而开发出两个叠加的集成模型，用于检测和肿瘤溯源。

利用来自 191 名非癌症患者和 217 名癌症患者（包括 49 名肠癌、30 名肝癌、106 名肺癌和 32 名胃癌患者）数据，然后从 217 名癌症 cfDNA 样本中，随机选择 75% 作为训练数据，25% 作为测试数据；从 191 名非癌症 cfDNA 样本中随机选择了 25% 作为测试数据，在剩余的 75% 中，随机保留了 30 个仅用于标志物发现的非癌 cfDNA 样本，并将剩余的非癌 cfDNA 样本用作训练数据，进行泛肿瘤的诊断效能评估。结果发现： 所有单个标志物类型在癌症检测中的曲线下面积（AUROC）>0.9，从高到低依次为癌症特异性高甲基化标志物 AUC：0.966、组织高甲基化标志物 AUC：0.957、癌症特异性低甲基化标志物 AUC：0.944、组织低甲基化标志物 AUC：0.939 。随即整合 4 种标记物获得的集成模型，其 AUC：0.974，在 97.9% 的特异度（即误诊一例）下，灵敏度为 80.7%，同时在早期癌症（I 或 II 期）样本，模型的 AUC：0.964，灵敏度为 74.5%。当将这些结果分解为不同癌症类型和分期时，灵敏度均达到或超过 63%。

03 模型对于肿瘤溯源预测能力评估

研究者又通过相同的验证策略评估癌症样本中模型的肿瘤溯源的预测性能。结果发现：在 4 个肿瘤类型中，癌症特异性高甲基化标志物的平均准确率为 80.0%，癌症特异性低甲基化标志物为 83.6%，组织特异性高甲化标志物为 79.4%，组织特异性低甲基化标志物为 80.0%。且低甲基化标志物相比高甲基化标志物预测准确性更优。通过整合四种标志物类型，肿瘤溯源预测集成模型在所有分期的平均准确率为 89.1%，在早期癌症患者，模型平均准确率为 85.0%。对于具体不同肿瘤类型的预测分析中，模型对于结肠癌、肝癌、肺癌和胃癌的预测准确率分别为 86.7%、89.7%、90.0%、83.3%，在早期模型预测准确率分别为 80.0%、81.2%、93.0% 和 81.8%。

总结

该研究开发了一个集成的实验和计算系统，用于解决当前基于 cfDNA 的早期癌症检测的主要挑战：即血液中的低肿瘤负荷，肿瘤的分子异质性，以及训练样本量太小而不能准确地代表疾病和患者群体的异质性等局限。cfMethyl-Seq 能够以经济高效地分析 cfDNA 的全基因组甲基化特征， 在四种常见类型肿瘤患者的血液分析中，展现了其检测肿瘤和肿瘤溯源具有较高的准确性，特别是对于早期患者的诊断同样有优异表现 ，且集成模型的诊断稳健性不依赖于其他混杂因素的干扰，再次验证了 基于 cfDNA 甲基化特征作为肿瘤早期检测具有重要价值 。

此外，多项研究表明羟甲基化谱（5hmC）同样在肿瘤早期诊断领域具有广泛前景，且甲基化 / 羟甲基化具有诊断互补价值。特别是在肺癌领域，5hmC 能够对风险人群实施筛查地判别早期肺癌患者，提高早期检测的准确性，在更早期发现癌症隐患并制定科学的诊疗方案，是降低肺癌死亡风险、提高长久生存的重要因素 。即开发了一种敏感的基于化学标记的低输入全基因组 5hmC 测序方法，可快速且准确地对 cfDNA 5hmC 进行测序分析，可潜在地应用于识别多种癌症类型，还可以用于追踪某些癌症的肿瘤分期。泰莱生物已将该项研究的技术成果与影像组学、代谢组学等多组学联用，应用于肺结节良恶性辅助鉴别和早期肺癌的筛诊产品中。

MISSION 计划拥有目前我国该领域内大（获得病理诊断结果）规模的临床研究队列，经过分析万例临床肺结节患者胸部 CT、血液中代谢物质及 cfDNA 羟甲基化水平数据，构建出了肺结节诊断多组学融合模型，并以此转化了斐盼安®（影像组学 + 代谢组学）、斐盼康®（影像组学 + 代谢组学 + 表观基因组学）两款产品，可对肺结节良恶性鉴别提供高效、可靠的参照，针对早期肺癌临床诊疗，包括肺癌早筛、早诊、性质判定、手术决策、预后评估等任务的优化与完善可起到相当的作用。 包括肺癌在内，癌症是全世界人类大的杀手之一。《“健康中国 2030” 规划纲要》中也曾对癌症防治树立了明确的目标，除了民众的日常保养外，早筛查、早诊断、早治疗是主要的有效手段。 5mC / 5hmC 作为表观遗传的重要机制，在癌症早筛和辅助诊断方面具有巨大的潜力和临床应用价值。 研究表观遗传学的机制将有助于人们更深入的解析肿瘤的发病机制原理、多因素之间的关系，进而更好地应用于肿瘤的预防、筛查、诊断以及治疗等领域 。 相信未来还会有更多新兴的检测技术方法，能够广泛应用于肿瘤筛查、辅助诊断领域，推动癌种诊疗的发展，帮助人们更便携、快速地实现癌症 “防大于治”。