外泌体作为阿尔茨海默病诊断标志物的新研究

阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。该病可能是一组异质性疾病，在多种因素（包括生物和社会心理因素）的作用下才发病。从研究来看，该病的可能因素和假说多达30余种，如家族史、女性、头部外伤、低教育水平、甲状腺病、母育龄过高或过低、病毒感染等。目前，我国阿尔茨海默病患者约1000万人，居全球之首，预计到2050年将突破4000万人。

神经元和星形胶质细胞衍生的外泌体已被确定为筛选AD生物标志物的佳来源。然而，很少有研究关注从AD血浆中分离的大量外泌体群体，该团队研究调查了散装外泌体中的蛋白质是否有助于AD的诊断。

血浆外泌体通过超速离心机收集，从外泌体中提取蛋白质样品，测量脑脊液中淀粉样蛋白β（Aβ）42和磷酸化tau（P-tau）181的水平以进行诊断。进行基于质谱的蛋白质组学来分析血浆外泌体蛋白质组，平行反应监测用于进一步确认差异表达的蛋白质。

1、确认外泌体采集

外泌体样品通过透射电镜进行鉴定，显示了来自AD患者和健康对照的外泌体的代表性TEM图像。蛋白质印迹分析显示，外泌体标记蛋白Alix在外泌体样品中高表达，而上层对标记物呈阴性。这些发现表明，外泌体已成功从血液样本中收集。

2、检测差异表达的外泌体蛋白

在 AD 患者和对照组的血液中总共定量了328种外泌体蛋白，在这些蛋白质中，相对于对照组，AD组中有15种蛋白质显着上调，16种蛋白质显着下调，由倍数变化≥1.2或≤0.80确定。

3、确认差异表达的外泌体蛋白

AD患者和对照组之间差异表达的31种蛋白质，7个上调（补体C1q亚组分亚基C（C1QC）、补体组分C9（CO9）、补体因子H（CFAH）、免疫球蛋白K变量2D-30（KVD30）、血小板糖蛋白Ibβ链（GP1BB）、Ras 抑制蛋白1（RSU1）、含Ig 样结构域蛋白（A0A0G2JRQ6））和5种下调蛋白（α-2-巨球蛋白（A2MG）、崩解蛋白和金属蛋白酶结构域10（ADA10）、α-1-酸性糖蛋白2（A1AG2）、免疫球蛋白重常数α1（IGHA1）， 来自试点研究的免疫球蛋白重变量4-28（HV428）），被证实具有显着差异表达。为了获得差异表达蛋白的详细生物学信息，我们对12种蛋白进行了生物信息学分析。GO分析显示，大多数蛋白质参与免疫系统调节和蛋白质激活级联反应，并在不同的细胞过程中作为结合分子发挥作用。大多数蛋白质定位于细胞外空间和细胞外囊泡，KEGG通路分析表明，这些蛋白质在免疫系统和传染病相关通路中富集多，例如补体和凝血级联，此外，B细胞受体信号通路以及补体和凝血级联与富集通路的连接密集，富集的通路与迟发性AD和脑淀粉样血管病有关。

4、外泌体蛋白诊断组合

开发了一个逻辑模型来估计上述12种蛋白质的性能，以区分AD患者和对照组，使用诊断（AD与对照）作为因变量，12种蛋白质作为协变量。在调整年龄，性别，教育年限和APOEε4状态后，发现一组六种蛋白质（上调：A0A0G2JRQ6，C1QC，CO9，GP1BB和RSU1;下调：ADA10）与AD相关。 年龄、性别和教育年限从进一步分析中删除，因为它们在逻辑模型中的P值>0.05。AD患者和对照组6种蛋白质的多重共线性诊断显示，所有耐受性均为0.1>，VIF为<10，特征值为>0，条件指数为<30，表明6种蛋白质之间没有显着的多重共线性。为了确定六蛋白组合的诊断能力，通过ROC曲线分析进一步评估了来自logistic模型的panel的预测值。获得的结果表明，六蛋白组合显示出出色的AD诊断能力，曲线下面积（AUC = 0.978，P<0.001）明显高于单个蛋白质（AUC = 0.627–0.774），表明六种蛋白质的组合对于获得有效诊断是必要的。