肠道微生物群的破坏导致上皮性卵巢癌对顺铂产生耐药性

上皮性卵巢癌(EOC)是妇科癌症死亡的主要原因。尽管对干预有初步反应，但高达80%的患者肿瘤复发并需要额外的治疗。对OC患者的回顾性临床分析表明，化疗期间使用抗生素与较差的总生存率有关。本研究评估了抗生素（ABX）治疗是否会影响EOC的生长和对顺铂的敏感性。在腹腔注射EOC细胞之前，给免疫正常或免疫缺陷小鼠提供未经处理的对照组或含有ABX的水(甲硝唑、氨苄青霉素、万古霉素和新霉素)，并每两周进行一次顺铂治疗，直到终点。与对照处理相比，ABX治疗的荷瘤小鼠表现出肿瘤生长加速和对顺铂治疗产生耐药性。ABX治疗导致顺铂治疗肿瘤中细胞凋亡减少，DNA损伤修复增加，血管生成增强，并且ABX治疗小鼠的肿瘤中含有比对照小鼠更高频率的顺铂增强肿瘤干细胞。粪便分析表明，ABX治疗破坏了非耐药性肠道微生物物种。来自对照处理小鼠的盲肠微生物群移植足以改善ABX治疗小鼠的化疗耐药性并延长其生存期，表明其具有肠源性肿瘤抑制作用。代谢组学分析确定了循环肠道衍生代谢物，这些代谢物因ABX治疗而改变，并通过再定植而恢复，提供了介导肠道微生物组和卵巢癌之间相互作用的候选代谢物。综上，这些结果表明，完整的微生物组在EOC中起肿瘤抑制作用，ABX治疗对肠道微生物群的扰动促进肿瘤生长并抑制顺铂敏感性。

结果

1 抗生素治疗的小鼠EOC肿瘤生长加速，对顺铂的敏感性减弱

我们测试了这样一个假设：抗生素驱动的微生物组破坏会影响EOC的肿瘤发展和化疗敏感性。为此，我们实施了以下研究范式，其中向6周龄的C57BL/6J雌性小鼠提供水或含抗生素的水（ABX；氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑和万古霉素），在研究期间持续提供。2周后，小鼠腹腔注射（IP）与BL/6小鼠同源的小鼠EOC细胞系ID8或ID8-VEGF。在研究期间，每周通过经腹超声(TAUS)监测肿瘤生长。ID8和ID8-VEGF细胞系被用于研究，因为它们具有高度特征性，并密切再现了人类卵巢癌的进展。ID8-VEGF细胞系略严重一些，可引起血管生成增加和腹水发展的增加。在肿瘤细胞注射后2周，每周给小鼠腹腔注射顺铂或赋形剂。小鼠的研究终点为肿瘤负荷达到>150mm3或人道终点(包括导致衰弱的腹水)。与对照组相比，ABX处理小鼠中ID8和ID8-VEGF EOC肿瘤生长增加。此外，在ABX存在的情况下，顺铂治疗的疗效与对照治疗的小鼠相比减弱，表明发生了顺铂耐药性。与对照组相比，ABX治疗组的中位生存期降低(图1D和E)。在ID8队列中，ABX安慰剂组和顺铂组的中位生存期分别为66天和64天，而H2O安慰剂组和顺铂组分别为68.5天和84天。在ID8-VEGF小鼠队列中，ABX安慰剂组和顺铂组的中位生存期分别为39天和34天，而H2O安慰剂组和顺铂组的中位生存期分别为42天和53天(图1E)。ID8-VEGF小鼠比ID8队列的小鼠更早达到终点。

尸检时，通过H&E染色的组织切片以及良性相邻网膜的组织学评估来确认EOC肿瘤表型。我们对来自ID8 H2O +顺铂和ABX+顺铂队列的ID8肿瘤进行了53BP1免疫荧光分析，发现与ABX队列相比，在H2O队列中53BP1升高。与这些发现一致，我们发现与ABX顺铂组相比，H2O顺铂组的TUNEL染色有所增加。这些结果与顺铂治疗的H2O组中DNA损伤的增加相一致，而在顺铂治疗的ABX小鼠中这一现象被削弱了。为了验证组织学结果，并进一步建立ABX小鼠肿瘤生长和化疗耐药性增加的机制，我们对53BP1、BRCA1和CD31(血管生成)进行了qRT-PCR。我们发现与H2O顺铂队列的肿瘤相比，ABX顺铂治疗小鼠的肿瘤中53BP1受到抑制。与H2O顺铂队列的肿瘤相比，ABX顺铂治疗小鼠的肿瘤中BRCA1表达增加，表明DNA损伤修复增加。此外，我们发现，与H2O顺铂队列的肿瘤相比，ABX顺铂治疗小鼠的肿瘤中CD31表达增加。综上所述，我们的结果表明ABX治疗通过抑制细胞凋亡、增加DNA损伤修复和增强血管生成来促进肿瘤生长。

A.研究设计的示意图，强调了治疗模式。B和C.未用或用顺铂治疗的H2O和ABX C57BL/6J小鼠中ID8和ID8-VEGF肿瘤生长动力学。D和E.未用或用顺铂处理的H2O和ABX C57BL/6J小鼠中ID8和ID8-VEGF生存动力学分析。在两个队列中，顺铂治疗(虚线)增加了H2O治疗小鼠的生存率(黑色，ID8 p<0.01)，但没有改变ABX治疗小鼠的生存率(红色)。F.对H2O+顺铂或ABX+顺铂处理的ID8细胞注射小鼠的肿瘤进行53BP1染色以评估DNA损伤和H&E。显示代表性切片。G. 对来自H2O+/-顺铂或ABX+/-顺铂小鼠的肿瘤进行TUNEL染色以检测细胞凋亡。H. 收集H2O+顺铂或ABX+顺铂小鼠的肿瘤，对53BP1、BRCA1和CD31进行qRT-PCR分析。（n = 4, *p<0.01）。

2 广谱抗生素对EOC腹水免疫人群的影响有限

大多数EOC患者表现为晚期疾病(Ⅲ期或Ⅳ期)，可能包括腹水。既往研究报道，在腹水中发现的NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞可能在肿瘤细胞的侵袭和生长中发挥关键作用。我们通过流式细胞术分析了腹水中的免疫细胞群。我们的分析侧重于骨髓细胞群和淋巴细胞群。在C57Bl/6J ID8-VEGF队列中，无论有无顺铂治疗，ABX治疗后的小鼠腹水中没有观察到骨髓细胞或淋巴细胞群的差异。当患者持续出现腹水时，对ID8-VEGF细胞进行分析。此外，在终点时，在收集的脾细胞或骨髓中，骨髓细胞群或淋巴样细胞群之间没有差异。

3 破坏免疫系统对抗生素治疗小鼠的EOC肿瘤加速生长或顺铂敏感性降低没有明显影响

为了评估ABX治疗后观察到的肿瘤生长和顺铂耐药的增强是否依赖于完整的免疫系统，在NSG免疫缺陷小鼠中利用了同样的研究范式。与H2O C57BL/6J队列相比，接种ID8或ID8-VEGF并接受ABX治疗的NSG队列显示出加速的肿瘤生长和更快的起效，而顺铂没有益处。在ID8队列中，肿瘤进展的时间加快，对中位生存期的影响更加，ABX安慰剂和顺铂组的中位生存期分别为41天和45天，而H2O安慰剂和顺铂组的中位生存期为55天和69天。在接种ID8-VEGF的NSG小鼠中也观察到类似的总生存率降低。通过流式细胞术分析在终点收集的腹水。NSG小鼠具有未成熟的T细胞、DCs和巨噬细胞，但具有功能性中性粒细胞。ID8-VEGF队列中的NSG小鼠在各治疗组中均出现腹水，但骨髓细胞群无变化。综上所述，研究结果表明ABX治疗影响小鼠EOC荷瘤小鼠的动力学和总体生存期。

在C57 BL/6 小鼠中注射ID8(A)和ID8 VEGF(C)细胞后，无论顺铂治疗与否，抗生素治疗的小鼠都表现出肿瘤生长增加。与H2O处理小鼠（黑色）相比，抗生素处理的ID8（B）和ID8 VEGF（D）注射NSG小鼠（红色）的中位生存期降低。此外，在任一队列中，顺铂治疗（虚线）增加了H2O处理小鼠的存活率（黑色，ID8＜0.01），但没有改变ABX处理小鼠的存活率（红色）。

4 ABX治疗导致C57BL/6J和NSG EOC荷瘤小鼠的肠道微生物组发生类似破坏

本研究使用的ABX治疗方案已被证明足以耗尽可检测到的共生细菌。然而，为了确定肠道微生物组对广谱抗生素治疗的应答，我们在基线、2周、顺铂开始用药、5周和终点尸检时收集粪便，并进行16S rRNA基因测序。我们分析了以下队列的微生物组：C57Bl/6J ID8、C57Bl/6J ID8-VEGF,、NSG ID8和NSG ID8-VEGF。

4.1 C57BL/6J队列

在ID8和ID8-VEGF BL/6队列中，每个治疗组有5只小鼠的粪便样本，通过对16S rRNA基因测序，总共获得了2,801,471和2,411,554条高质量的可用reads，平均长度为210个碱基对（bps）。所有ID8和ID8-VEGF BL/6样本中，有3,184个扩增序列变异(ASVs)。在ID8和ID8-VEGF队列中的配对比较显示，通过香农多样性指数（ANOVA）的分析，不同时间集合之间的α多样性存在统计学差异。此外，在ID8和ID8-VEGF队列中，基于Bray-Curtis差异的β多样性比较在p=0.003和p=0.001时具有。无论顺铂治疗与否，抗生素治疗组的粪便微生物群落多样性明显低于对照组。具体来说，在抗生素治疗的ID8组中，一些Proteobacteria （包括Enterobacteriaceae和Parasutterella）的相对丰度增加，而在抗生素治疗的ID8-VEGF组中，Enterobacteriaceae丰度增加。作为革兰氏阴性菌和大多数兼性厌氧菌，Proteobacteria通常对万古霉素具有抗性，而万古霉素主要影响革兰氏阳性菌；Proteobacteria对甲硝唑也不太敏感，而甲硝唑主要影响厌氧菌。此外，Enterobacteriaceae有多种抗生素耐药基因，允许其在整个ABX治疗过程中存活。Parasutterella的丰度增加与肠道微生物组的失调有关，但这种关联背后的机制还没有被完全阐明。

4.2 NSG队列

在ID8和ID8-VEGF NSG队列中，每个治疗组有5只小鼠的粪便样本，通过对16S rRNA基因测序，总共获得了4,784,498和2,822,423条高质量和可用的reads，平均长度为210个碱基对。在所有ID8和ID8-VEGF NSG样本中，有6484个ASVs。与BL/6队列一样，配对比较显