氧化胆固醇暴露通过调节肠道菌群对结肠炎产生不利影响

胆固醇和氧化胆固醇(OXC)都存在于人类饮食中。炎症性肠病(IBDs)的发病率在世界范围内呈上升趋势。本研究以C57BL/6小鼠为模型，探讨OXC促进结肠炎的机制。结果表明，在水中添加葡聚糖硫酸钠(DSS)后，OXC处理小鼠的结肠炎加重。在健康小鼠中未观察到短期OXC暴露对肠道屏障或炎症的直接影响。然而，OXC暴露可能导致肠道微生物群失调，产生短链脂肪酸(SCFAs)的细菌(Lachnospiraceae_NK4A136_group和Blautia)的相对丰度降低，而一些潜在有害细菌(Bacteroides)的丰度增加。给小鼠注射抗生素后，OXC诱导的结肠炎症状消失，表明OXC对DSS诱导的结肠炎的促进作用是通过其对肠道微生物群的影响介导的。此外，用OXC-DSS暴露小鼠的肠道微生物组定植细菌耗竭小鼠后表现出严重的结肠炎，进一步证明由OXC暴露引起的肠道生态失调是加剧结肠炎的罪魁祸首。由此可见，饮食中的OXC暴露通过引起肠道菌群失调而增加小鼠结肠炎的易感性。

结果

1.OXC暴露促进实验性结肠炎

为了评估OXC对炎症性肠病(IBDs)的影响，在诱导小鼠结肠炎之前连续2周每天给药1.356 mg OXC。所采用的OXC剂量已被广泛应用于高胆固醇饮食小鼠模型。然后用2.5% DSS诱导小鼠结肠炎，同时给予含OXC混合物的玉米油或对照玉米油5天。与对照组相比，OXC暴露促进了化学诱导结肠炎小鼠的体重急剧下降以及从第三天DAI指数增加。在实验的混有OXC处理的小鼠遭受了更严重的结肠炎，导致严重出血以及体重下降近20%，而对照组小鼠仍相对健康，体重下降不到10%。DSS处理5天后的形态学和组织病理学变化结果显示，OXC暴露小鼠的结肠长度比对照组短，并表现出结肠隐窝损伤加重等炎症特征。在OXC混合物处理的小鼠中，MPO、IL-1β和细胞凋亡增加。此外，经OXC混合物处理的小鼠和对照小鼠的水和鼠粮摄取量具有可比性(数据未显示)，表明炎症进展不受水或饮食热量消耗的影响。这些结果表明，短期暴露于OXC可加重DSS诱导的小鼠结肠炎。

2.OXC暴露不会直接改变结肠病理生理

根据不同的体外实验，此前的研究已经报道了OXC的有害作用，包括促凋亡和促炎症。为了进一步评估OXC暴露导致结肠炎症的潜在机制，我们研究了短期OXC暴露是否会直接影响结肠状况。小鼠分别给予含OXC混合物的玉米油或对照玉米油两周，不给予DSS。在暴露结束后，我们发现OXC暴露小鼠的结肠没有明显的隐窝或上皮损伤。OXC处理小鼠和对照小鼠的结肠切片显示相似的少量TUNEL阳性细胞。为了进一步评估OXC处理小鼠的稳态状态，我们还用Ki67免疫组化染色来测量细胞增殖。结果发现，与对照小鼠相比，OXC处理小鼠结肠组织中Ki67阳性细胞的数量和分布模式相似，表明OXC暴露没有直接引起肠道损伤。

肠道屏障的损伤被认为是结肠炎的重要诱因。因此，作者研究了OXC暴露对结肠肠道屏障的直接影响。首先，研究了OXC对结肠粘液分泌杯状细胞数量的影响，发现OXC暴露小鼠的杯状细胞数量与对照小鼠相当。同样，免疫荧光染色和实时qPCR结果显示，OXC处理小鼠与对照小鼠Muc2的表达无差异。同时发现，与对照小鼠相比，OXC暴露并未改变两种紧密连接蛋白(ZO-1和occludin)的表达。同时，促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的基因表达无差异。这些结果清楚地表明，短期口服暴露OXC不会引起明显的结肠病理生理变化。

3.OXC暴露改变了肠道菌群组成并降低了SCFAs

饮食组成是影响肠道菌群的因素之一。我们推测OXC暴露可能导致肠道菌群失调。维恩图显示，对照组小鼠有351个独特特征，而OXC处理的小鼠只有92个独特特征。基于Chao指数的α-多样性也表明，与对照组相比，OXC处理小鼠的肠道微生物群丰富度明显降低(p = 0.0039, n = 9)。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，与对照小鼠相比，OXC暴露组具有明显的分离聚类模式，说明OXC暴露改变了肠道微生物群的β-多样性。 此外，OXC处理小鼠和对照组之间肠道菌群的总体情况和组成在门水平上也显示了潜在的差异)。结果表明，OXC暴露影响了几个细菌门的相对丰度。具体而言，与对照小鼠相比，OXC暴露小鼠的拟杆菌门和蓝细菌门明显富集，而厚壁菌门明显减少。为了进一步确定OXC处理组细菌类群的变化，我们在属水平上进行LEfSe和热图的比较。可以明显看出，在OXC处理的小鼠中，Lachnospiraceae_NK4A136_group的相对丰度降低，而拟杆菌属(Bacteroides)和Gastranaerophilales的相对丰度增加。总体而言，这些结果表明，OXC暴露小鼠的肠道微生物群结构发生了改变。

肠道菌群产生SCFAs与结肠内稳态和免疫功能有着广泛的联系。显然，OXC处理小鼠中产生SCFAs的细菌(包括Lachnospiraceae_NK4A136_group)的减少可能是结肠生态失调的潜在触发因素。与对照小鼠相比，OXC处理小鼠中SCFAs的产生减少。作者认为，OXC处理小鼠肠道菌群结构的改变是导致结肠炎症加重的罪魁祸首。

4.OXC诱导的结肠炎是由微生物群失调介导的  

为了确定与OXC暴露相关的微生物群失调对结肠炎的潜在影响，使用抗生素来消耗小鼠肠道细菌。分别比较两种抗生素处理小鼠(ABX-CON和ABX-OXC)与两种非抗生素处理小鼠(CON和OXC)的结肠炎严重程度。4组均在饮水中给药DSS。体重减轻是结肠炎的标志之一。很明显，两种抗生素处理小鼠(ABX-CON和ABX-OXC)的体重相似，而两种非抗生素处理小鼠(CON和OXC)的体重不同，前者的体重明显大于后者。在两个非抗生素处理组之间，OXC小鼠的结肠长度较短，而两个抗生素处理组的结肠长度相似。同样，在两个未使用抗生素的小鼠中，OXC小鼠具有更高的疾病活动指数和组织学评分，而两个抗生素处理组之间没有差异。与对照组相比，未经抗生素处理的OXC小鼠杯状细胞数量减少，而ABX-OXC组和ABX-CON组小鼠的杯状细胞数量和凋亡数量无差异。这些结果清楚地表明，OXC可能通过其对肠道生态失调的因果作用而不是直接影响肠道结构来加剧DSS诱导的结肠炎。

5.OXC-DSS处理小鼠的粪便菌群移植(FMT)可加重抗生素处理小鼠的结肠炎  

为了进一步研究OXC型肠道微生物群是否是DSS诱导小鼠结肠炎的原因，我们对抗生素处理的伪无菌小鼠进行了FMT实验。取两组供体粪便微生物群，第一组给予玉米油和DSS处理，第二组给予含OXC混合物的玉米油和DSS处理。每天收集新鲜粪便进行微生物群重建。两组患者均先用抗生素处理。在抗生素处理前后测量受体组的粪便DNA浓度，以确保细菌消耗。在建立伪无菌条件后，进行FMT治疗，移植后恢复两个受体小鼠组(CON-R和OXC-R)粪便中的细菌富集。与接受CON-D小鼠粪便的CON-R小鼠相比，接受OXC-DSS处理的供体粪便的小鼠表现出更严重的结肠炎，体重减轻，结肠长度缩短以及结肠组织病理学损伤。与CON-R组相比，OXC-R组小鼠粘液分泌杯状细胞减少和细胞凋亡增加。FMT实验的所有结果都强烈表明，OXC暴露引起的肠道生态失调介导了小鼠的促炎性结肠炎，而不是OXC本身。

讨论

肠道中生活着数万亿微生物，对宿主免疫系统的发育、能量代谢和肠道屏障的完整性起着至关重要的作用。一方面，健康的肠道环境需要高丰度和丰富的功能性微生物群。另一方面，肠道微生物群及其代谢物的生态失调可能是肠道炎症和不良免疫反应的潜在触发因素。肠道菌群分布是宿主基因和各种环境条件共同作用的结果。在这些环境因素中，膳食成分可以直接调节共生微生物群。先前的报道表明，OXC在体外实验中具有一些潜在的促凋亡、促炎症和肠屏障损伤作用。作者之前的研究已经明确表明，OXC是体内引起化学性结肠炎的潜在有害物质。然而，OXC如何促进DSS诱导的结肠炎尚不清楚。本研究结果提示，OXC暴露不会直接引起肠道炎症，也不会引起明显的结肠病理生理改变。相反，本研究进行了第一个FMT实验，证明OXC对DSS诱导的结肠炎的促炎作用是通过调节肠道微生物群组成来介导的。 本研究细菌16S rRNA基因测序分析的结果清楚地表明，OXC暴露可以通过大量减少肠道微生物群的生物多样性来诱导促炎肠道微生物群结构。类似的现象也有报道，IBDS患者肠道微生物群组成发生改变，肠道微生物群多样性下降。在门水平上进一步分析发现，OXC处理小鼠的拟杆菌门和厚壁菌门之间存在失衡，相对于厚壁菌门，拟杆菌门过度扩张(图3)，这是IBDs肠道生态失调的特征之一。与其他DSS诱导结肠炎模型的报道相似，本研究也发现，在暴露于OXC的小鼠中，蓝细菌的相对丰度增加。

本研究表明，OXC暴露可使一些有益菌及其代谢产物死亡。Lachnospiraceae_NK4A136_group是存在于小鼠肠道中的主要菌属之一，是一种潜在的有益菌。OXC暴露可降低Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度。Lachnospiraceae_NK4A136_group属于无氧、产孢细菌的毛螺菌科，Lachnospiraceae_NK4A136_group可通过发酵膳食多糖产生SCFAs，与多种代谢性疾病和慢性炎症呈负相关。虽然Lachnospiraceae_NK4A136_group在结肠炎发生和进展中的直接保护机制尚不清楚，但有报道显示其具有潜在的抗结肠炎活性。此外，OXC暴露还可以减少其他几种产生SCFAs的细菌，与产生SCFAs的细菌的变化一致，在OXC暴露的小鼠中观察到粪便中SCFAs减少。事实上，SCFAs(包括乙酸、丁酸和丙酸)是由肠道微生物群产生的，对维持肠道屏障和免疫系统的完整性至关重要。研究表明，丁酸可促进Rag1-/-小鼠结肠调节性T细胞的数量和功能，改善CD4+CD45RBhiT细胞过继性转移引发的结肠炎。此外，丁酸可以抑制中性粒细胞功能，改善炎症性肠病的粘膜炎症。

本研究结果发现，OXC暴露会增加几种潜在的有害细菌。首先，在OXC处理的小鼠中观察到拟杆菌(Bacteroides)和阿克曼氏菌(Akkermansia)的相对丰度增加。拟杆菌是革兰氏阴性菌和厌氧菌，存在于包括人类在内的许多哺乳动物的肠道中，并与IBD易感小鼠模型中的结肠炎有关。例如，产酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)是降解黏液的细菌，参与结肠炎的发病机制。先前的研究表明，高糖饮食可通过促进Akkermansia的富集和肠道屏障损伤而加重结肠炎。虽然Gastranaerophilales是OXC组中的另一个优势属，但其在结肠炎中的确切作用尚未得到研究，需要进一步的研究。 肠道菌群耗竭和转移实验进一步证实了OXC改变的肠道菌群在结肠炎进展中的不利作用。与野生型小鼠不同，暴露于OXC会产生更严重的结肠炎，肠道微生物群耗尽的小鼠在有无OXC处理的情况下对结肠炎表现出相似的易感性。这些结果直接证明了肠道菌群失调对OXC暴露小鼠结肠炎易感性的促进作用。此外，粪便菌群移植实验清楚地表明，肠道菌群的改变会加重小鼠模型的结肠炎。总体而言，本研究结果直接证明口服OXC暴露首先会导致肠道细菌生态失调，然后肠道菌群的改变会加重DSS诱导的小鼠结肠炎。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，实验是在小鼠模型上进行的，小鼠的肠道菌群组成与人类的不太相同。因此，OXC暴露对人类肠道健康的确切影响应在临床上进一步评估。其次，OXC改变的肠道微生物群组成对肠道健康和环境的确切作用和功能尚不清楚，因此需要进一步研究。 综上所述，本研究发现口服OXC会对小鼠肠道菌群组成产生不利影响，导致肠道菌群失调。更有可能的是OXC引起的肠道菌群失调，而不是OXC本身是促进DSS诱导结肠炎的罪魁祸首。虽然OXC对人类肠道健康的影响尚不确定，但本研究提供了高OXC摄入量与肠道健康之间可能存在关联的证据。