纳米抗体在小分子化合物检测的应用

人们在重链抗体可变区片段（variable domain of the heavy chain of heavy- chain antibody， VHH） 基础上开发了一种仅由重链可变区构成的单域抗体（single domain antibody， sdAb），长4 nm，直径2.5 nm，分子量为12–15 kDa，是目前已知小的活性抗原结合蛋白，仅为传统抗体大小的十分之一，也被称为纳米抗体（nanobody，Nb），其独特的结构和优越的特性使其成为多领域的研究热点。

纳米抗体在环境污染物、生物毒素等小分子化合物的检测中不仅降低了检测下限，提高了灵敏度和精确度，而且通过优化测定过程，能够实现快速简便的检测，推动免疫检测方法和传感技术的快速发展，纳米抗体（nanobody，Nb）在竞争性ELISA法、免疫PCR、荧光偏振免疫分析和横流免疫分析等免疫检测技术的研发中取得了许多积极成果。

中国农业大学Liu等用半抗原CBR1与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin， KLH） 偶联，将CBR1-KLH进行皮下免疫羊驼，然后经提取总RNA、PCR扩增VHH片段、酶切、转化等步骤后成功构建VHH库，构建的文库大小约为1×108 CFU/mL，经过洗脱、淘选、纯化等一系列过程后制备了甲萘威特异性VHHs，开发了基于纳米抗体（nanobody，Nb）的免疫测定方法检测谷物中的广谱氨基甲酸酯类杀虫剂甲萘威（carbaryl），且在谷物样品中的可重复性和再现性良好。基于纳米抗体（nanobody， Nb）的小分子检测在这项研究中具有一定的基础应用。

纳米抗体（nanobody， Nb）在农药兽药残留以及重金属检测中表现出较高的应用价值。Li等研究发现纳米抗体-碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP） 对除草剂2, 4-二氯苯氧基乙酸（2, 4-d） 表现出优异的敏感性和特异性（IC50=29.2 ng/mL），2, 4-d深埋在CDR3和CDR2形成的袋中，NB3-9的结合袋通过氢键和疏水力与2, 4-d的相互作用，在此基础上开发了以纳米抗体-碱性磷酸酶（AP） 融合为基础的2, 4-d一步荧光酶免疫测定法（one-step fluorescent enzyme immunoassay， FLEIA），通过分析比较确定了FLEIA法可作为一种监测环境中2, 4-d残留的便捷工具。3-苯氧基苯甲酸（3-PBA） 被广泛用作人类拟除虫菊酯类杀虫剂暴露的常见生物标志物，近期El-Moghazy等研制了一种基于纳米抗体的新型电化学竞争免疫传感器用于3-PBA的快速检测，检测限为0.64 pg/mL，检测限远低于胶体金/单克隆抗体/侧向流动免疫分析方法，LOD为130 ng/mL。

纳米抗体（nanobody， Nb）在检测食品和环境真菌毒素方面展现了强大的应用前景。Wang等开发并优化了PO8-VHH的纳米抗体-多克隆抗体夹心ELISA法测定农产品中的曲霉病菌，能够达到1 μg/mL浓度的检测效果，进而监测农产品曲霉污染。Tang等使用OTA和抗OTA Nb分别与两种尺寸的高效荧光标签-量子点（quantum dot， QD） 共价耦合，制备了OTA标记的GQD结合物（OTA-GQD） 和Nb28标记的RQD偶联物（Nb-RQD） 分别作为能量供体和受体，如下图所示，开发出一种Nb-FRET（荧光共振能量转移） 免疫传感器用于检测谷物样品中赭曲霉毒素A （ochratoxin， OTA），易于表达、小尺寸的Nbs可以缩短两个QD之间的有效距离，从而提高检测灵敏度，单步测定可以在5 min内完成，检测限为5 pg/mL。

纳米抗体的获得主要通过免疫羊驼由羊驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基因，然后通过噬菌体展示筛选技术来从羊驼抗体库中筛选得到适合的抗体序列。整个流程主要包括羊驼免疫、噬菌体文库构建和抗体筛选三个阶段。