DNA甲基化-肿瘤免疫逃逸-肾上腺皮质癌侵袭的相关性

肾上腺皮质癌（Adrenocortical carcinoma，ACC）是一种罕见的侵袭性肾上腺内分泌癌。在肾上腺皮质癌中，研究表明以CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype，CIMP)为特征的亚型与特别差的预后相关。然而CIMP的驱动因素仍然未知。此外，CIMP与肾上腺皮质癌患者临床预后不良之间的功能关系尚不明确。

该研究通过RRBS、RNA-seq等组学研究揭示了由DNMT1和DNMT3A驱动的DNA高甲基化有利于肿瘤免疫逃逸，从而导致肾上腺皮质癌侵袭。

研究摘要：

本研究通过RRBS、RNA-seq等分析结果表明肾上腺皮质癌（ACC）中的CIMP与DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3A高表达有关，而这主要由基因拷贝数的增加和细胞过度增殖驱动。此外，本研究验证了CIMP通过促进肿瘤免疫逃逸以促进肿瘤的侵袭性，而通过用去甲基化剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine）处理可以至少部分逆转这种效应。

本研究结果表明，与去甲基化药物联合治疗可能会提高免疫治疗的疗效，并可能为高CIMP肾上腺皮质癌患者提供一种新的治疗方法。

研究结果：

（1）ACC中的CIMP与DNMT1和DNMT3A高表达相关

DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2和TET3在TCGA数据集患者中lCIMP (n = 32)、iCIMP (n = 26)、hCIMP (n = 21)的表达水平（双侧t检验，***p<0.005）。

根据TCGA数据集的DNMT1或DNMT3A表达（分为高、中、低），利用Kaplan–Meier分析ACC患者的总生存率。

在含有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因的染色体中hCIMP-ACC和lCIMP-ACC的拷贝数变化模式。

TCGA患者DNMT1和DNMT3A基因拷贝数状态的表达水平。

（2）拷贝数异常和增殖增加共同导致了ACC中DNMT高表达

a-b. DNMT1（a）或DNMT3A（b）表达与细胞增殖之间的相关性；hCIMP样本（n=21，橙色），iCIMP（n=26，黄色）和lCIMP（n = 32，蓝色）。

c. 使用TCGA数据集的偏相关分析对DNMT基因的基因组拷贝数状态、细胞增殖和基因表达之间的相互依赖性进行建模。Rpartial表示在调控第三因素时计算的Pearson偏相关系数。

d-e. 分别用1µM或5µM的增殖抑制剂AZD-5438（AZD）处理hCIMP-ACC和lCIMP-ACC细胞系H295R（d）和MUC-1（e）48h后，分析对DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和增殖标记物MKI67表达的影响。使用DMSO作为载体。数据表示4个生物重复的平均值±SEM（Wilcoxon检验，*p<0.05，**p<0.01）。

（3）高CIMP和低CIMP肿瘤在增殖和免疫反应基因表达特征方面存在差异

对TCGA数据集中hCIMP肿瘤中DNA甲基化抑制基因的通路富集分析。使用完整的KEGG通路数据集分析，图中只描述富集的通路。

在TCGA数据集的lCIMP (n=32)， iCIMP (n=26)和hCIMP (n = 21)样本中，使用mcp计数器计算肿瘤浸润的免疫和非免疫基质细胞群的相对丰度。使用Kruskal-Wallis检验比较每个种群的相对丰度，然后使用Benjamini-Hochberg校正的Dunn检验。***p < 0.001。

左：肿瘤浸润CD3+ T细胞百分比的定量。数据来自至少6个生物重复的平均值±SEM。Mann-Whitney U检验p=0.12。右：高浸润lCIMP样本和低浸润hCIMP样本的代表性截图

（4）用DNA去甲基化剂处理hCIMP-ACC细胞系可重新激活与免疫系统相关的基因

AZA处理后，H295R(5242个基因)、MUC-1(125个基因)和HUVEC(254个基因)细胞系中，存在上调或下调的基因重叠(FDR < 0.05)。

经5 μM AZA处理或未处理的3种细胞系(H295R, MUC-1和HUVEC)的启动子CpG岛甲基化情况，进行无监督分层聚类。使用甲基化水平变化大的CpG (s.d. > 0.4)进行聚类分析。

在RRBS reads覆盖的CpG中甲基化CpG的整体百分比。AZA诱导三种细胞系CpG甲基化水平降低，但这种作用在DNA甲基化基础水平低的MUC-1细胞系中不太明显。

AZA诱导H295R基因启动子去甲基化的通路富集分析。与免疫应答相关的通路用红色突出显示。

位于两个免疫应答基因启动子H295R的差异甲基化区域(DMRs)示例。

研究小结：

本研究结果阐明DNMT1和DNMT3A高表达是基因拷贝数增加和细胞过度增殖的结果，构建了ACC中CIMP原因和结果的表型机制研究。此外，研究揭示了CIMP通过促进肿瘤免疫逃逸对肿瘤的侵袭性产生直接影响(图5)。且通过去甲基化剂AZA处理，这一作用可以至少部分逆转。总之，本研究结果强烈表明，DNA去甲基化药物和免疫治疗药物联合治疗hCIMP-ACC患者可能对患者生存产生积极影响。