软骨复合物对小鼠类风湿性关节炎的预防作用

【摘要】  目的 观察口服软骨复合物对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的预防作用。方法 口服软骨复合物两周后，再注射弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant，FCA)诱发小鼠RA模型，通过观察小鼠关节炎分数的变化，测定小鼠各器官的指数，检测小鼠血清中一氧化氮(nitric oxide，NO)和肿瘤坏死因子α(TNFα)水平以及关节组织病理学的变化来评价口服软骨复合物对类风湿性关节炎的预防作用。结果 软骨复合物能较有效的改善关节的肿胀度，并显著地提高小鼠的胸腺指数(P<0.01)，显著地提高脾指数(P<0.05)，明显降低NO和TNFα水平；组织病理学显示给药组关节的变形破坏得到减轻。结论 软骨复合物能有效地起到预防佐剂性关节炎的作用，然而其治疗作用还有待进一步研究。

【关键词】  软骨复合物 关节炎 风湿性 一氧化氮 肿瘤坏死因子α

    Preventive Effect of Cartilage Compound on Rheumatoid

    Arthritis in Mice

    LIU Yingfen，ZHANG Guorong，CHEN Hongshuo，LIU Anjun

    (Department of Food Engineering & Biotechnology，Tianjin University of Science

    & Technology，Tianjin 300457，China) 

    【Abstract】  ob[x]jective  To investigate the preventive effect of cartilage compound on rheumatoid arthritis (RA) in mice. Method  The animal model was set up by injection of Freund′s complete adjuvant (FCA). After oral administration of cartilage compound for 2 weeks，the changes of mean arthritic index were observed，indexes of organs were tested，changes of nitric oxide (NO) concentrations was assessed，tumor necrosis factor α (TNFα) in blood serum was examined，and histological examination was carried out to evaluate the preventive effect on RA. Results  The cartilage compound alleviated the swelling of the joints. The index of thymus was increased significantly (P<0.01). The index of spleen was also increased (P<0.05). Oral administration of cartilage compound decreased the concentrations of NO and TNFα，and suppressed the histopathological changes in RA mice. Conclusion  The cartilage compound shows obvious preventive effect on rheumatoid arthritis in mice，induced by Freund′s complete adjuvant. However，its therapeutic action need to be studied further.

    【Key words】  Cartilage compound;  Ahritis，rheumatoid;  NO;  TNFα

    牛鼻软骨的主要成分为Ⅱ型胶原蛋白和软骨多糖。据国内外相关报道，口服牛源和鸡源Ⅱ型胶原蛋白均能使机体产生口服耐受，从而预防佐剂性关节炎［1］；胶原多肽对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用［2］；硫酸软骨素已在临床上用于治疗风湿痛、关节炎、肾炎、腰痛、神经痛及头痛且取得较好疗效，并发现口服几乎无，但对于软骨复合物的研究较少［3］。

    在日本，胶原食品已被作为健康食品推向市场，已经有胶原多肽等保健性食品上市［4］。在美国，氨基葡聚糖和硫酸软骨素的合成制剂已添加至食品中，具有非常高的安全信度［5］，但我国在此方面还是空白。本研究以牛鼻软骨为原料，经过处理得到胶原多肽和软骨多糖的复合物，并以弗氏完全佐剂建立小鼠类风湿性关节炎模型来研究其预防作用，为类风湿性关节炎的预防提供新的物质。

    1  材料和方法

    1.1  软骨复合物制备

    取牛鼻软骨洗净，6 mol/L盐酸脱钙24 h，洗净，-20℃冷冻，用切片机切细后，胶体研磨成粉，软骨粉与碱性蛋白酶以2：1 000比例于52℃水浴中加热水解10 h，其间不断搅拌并一直保持pH 8.5，得到消化液后离心取上清液，冷冻干燥即得到实验用的软骨复合物干粉。

    1.2  实验动物

    昆明种小鼠，雄性，体重(20g±1)g，由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心提供，许可证号SCXK(军)2002001。

    1.3  试剂

    弗氏完全佐剂为Sigma公司产品；一氧化氮(NO)含量检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子α(TNFα)试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

    1.4  仪器

    酶标仪，Thermo Electron，美国；LXJ6401离心机，河北省吴桥电机厂。

    1.5  实验分组及模型建立

    30只昆明种清洁级小鼠，普通饲料适应喂养1周后，将小鼠随机分为3组。软骨复合物溶于蒸馏水，按照每天1 500 mg/kg计算给药量［6］。每天灌胃1次，空白组和模型组均予相同体积的蒸馏水灌胃，给药组灌胃两周后，应用弗氏完全佐剂建立关节炎模型。于模型组和给药组小鼠右后足趾一次性注射0.1 mL的弗氏完全佐剂建立类风湿性关节炎模型，对照组注射0.1 mL的生理盐水。

    1.6  小鼠关节病变的发生和严重程度观察

    建立类风湿性关节炎模型后开始观察关节的原发性急性(7 d之内)病变情况，每天观察1次。用卡尺测量小鼠足跖厚度和关节的宽度，与正常小鼠比较，增加0.1～0.2 mm为轻度肿胀，增加0.3～0.4 mm为中度肿胀，增加超过0.5 mm为重度肿胀。以小鼠至少有一只脚爪在连续两次观察中出现红肿，作为关节炎发生的标准［7］。并且按以下标准对四肢关节病变程度进行评分：0分为正常，1分为轻度红肿，2分为中度红肿，3分为严重肿胀，4分为关节变形、强直［8］。每只动物的关节炎评价分数为四肢关节评价分数之和。该组所有小鼠关节炎评价分数的总和除以该组小鼠的只数，即为该组平均关节炎评价分数(mean arthritic index，MAI)。

    1.7  小鼠器官指数的测定

    建立类风湿性关节炎模型12 d后，将小鼠解剖，取出胸腺、脾脏并称重，计算胸腺指数、脾指数和肝指数。胸腺指数=胸腺重(mg)/体重(g)；脾指数=脾重(mg)/体重(g)。

    1.8  小鼠相关血清指标的测定

    建立类风湿性关节炎模型12 d后，将小鼠摘除眼球采血，然后用血清测定NO和TNFα含量。NO含量用硝酸还原法测定，TNFα采用双抗体夹心ABCELISA法测定。

    1.9  小鼠关节组织病理学观察

    建立模型12 d后，取小鼠踝关节关节窝于4%多聚甲醛中固定12 h，EDTA脱钙，脱水，石蜡包埋，组织切片(厚度5 μm)进行HE染色。

    1.10  统计学方法

    数据用±s表示，采用组间t检验。

    2  结果

    2.1  软骨复合物对小鼠关节炎评价分数的影响

    如表1所示为软骨复合物对小鼠原发性关节炎评分的影响，表中所示1 d为注射前的评分，注射佐剂后，模型组和给药组小鼠均出现了不同程度的炎症反应，均在第3天达到高峰，小鼠出现右后足红肿、热，严重者不能负重的急性炎症表现，而模型组一直极显著高于对照组(P<0.01)。从第4天开始3组小鼠的炎症均逐渐消退。在注射佐剂后第3 d和4 d，给药组与模型组差异不显著，但随着时间的延长，给药组在第5天和第6天时的效果与模型组相比差异具有显著性(P<0.05)；说明灌胃软骨复合物能较有效的改善急性炎症期小鼠关节的肿胀度。表1  软骨复合物灌胃对关节炎评价分数的影响注：* P<0.05与对照组相比；** P<0.01与对照组相比；△ P<0.05，△△ P<0.01与模型组相比。

    Note：* P<0.05 vs. control group；** P<0.01 vs. control group; △ P<0.05，△△ P<0.01 vs. model group.

    2.2  软骨复合物对小鼠器官指数的影响

    表2为小鼠各器官指数，从表中可以看出，给药组小鼠的胸腺指数极明显高于模型组和对照组（P<0.01），且组内差异不显著；给药组的脾指数比模型组高但并无显著的差异，但明显地高于对照组(P<0.05)。表2  各组小鼠器官指注：*P<0.05与对照组相比；**P<0.01与对照组相比；△P<0.05，△△P<0.01与模型组相比。

    Note：* P<0.05 vs. control group；** P<0.01 vs. control group; △ P<0.05，△△ P<0.01 vs. model group.

    2.3  软骨复合物对小鼠血清中NO和TNFα含量的影响

    从表3中可见，给药组的小鼠血清中的NO含量明显低于模型组(P<0.05)，但与对照组并无差异；模型组小鼠血清中的NO含量明显高于对照组(P<0.05)。给药组的小鼠血清中的TNFα含量极明显低于模型组(P<0.01)并且与对照组并无明显差别；模型组小鼠血清中TNFα含量明显高于对照组(P<0.05)。表3  小鼠血清中NO和TNFα含量测定结果注：* P<0.05，** P<0.01与对照组相比；△ P<0.05，△△ P<0.01与模型组相比。

    2.4  软骨复合物对小鼠关节组织病理学变化的影响

    图1所示为关节窝的HE染色，图中可以看出对照组关节软骨层较厚，表面平滑，未见关节软骨结构破坏，而与对照组相比，模型组和给药组的软骨层都有结构上的改变，均呈现出关节软骨厚薄不均，软骨层表面粗糙，但相比模型组，给药组的病理改变有所减轻（图1见彩插）。

    3  讨论

    类风湿关节炎(RA)为自身免疫性疾病。完全弗氏佐剂(FCA)诱导产生佐剂性关节炎，因其临床表现、病理组织学及免疫学特征都与人类的RA极为相似，因而被认为是研究人类RA的理想模型。据报道，口服胶原蛋白可诱导外周免疫系统产生抗原特异性无反应状态，引起机体对该抗原产生全身性低免疫应答状态，其主要通过肠黏膜淋巴组织激活T细胞，释放出抑制性细胞因子，降低自身免疫性疾病患者病灶处的炎症细胞数，从而抑制炎症反应。牛软骨中含有丰富的Ⅱ型胶原蛋白和软骨多糖。为了证实胶原多肽和软骨多糖共同作用能提高机体免疫力，起到预防关节炎的作用，我们对小鼠进行灌胃给药，探讨软骨复合物可能的预防作用。

    在本实验中观察到小鼠在注射完全弗氏佐剂的次日会出现右后足红肿且热，关节处也能观察到有明显的肿胀，严重者不能负重等急性炎症表现，约持续3 d，该肢体炎症逐渐消退，这与佐剂性关节炎的特征相符［9］，说明通过小鼠足趾部皮下注射完全弗氏佐剂，可以形成小鼠关节炎炎症模型，而从结果中可以看出，给药组的关节炎指数能较明显低于模型组，即通过给药能较好的缓解此急性炎症，起到预防关节炎的作用。小鼠器官的指数也可以看出，该复合物能提高免疫器官的指数，有利小鼠的生长，提高小鼠的免疫力。NO作为一种高反应性细胞毒的自由基，与机体特异性免疫反应、自身免疫病密切相关，其在许多疾病中对组织造成损伤已得到了证实，而实验结果表明通过口服软骨复合物能有效地降低小鼠体内NO的含量，缓解了小鼠体内的炎症。TNFα是RA关节损伤的病理过程中单核巨噬细胞产生的炎性细胞因子，是关节软骨破坏的重要炎性介质和RA发病机制中居中心地位的促炎症细胞因子，参与机体免疫反应和炎症反应，在关节炎免疫反应中发挥重要的作用［10］。他的作用与含量有关，正常水平对机体有利，产生过多会引起一系列炎性损害，并被认为是关节炎病程中调节其他细胞因子表达的关键细胞因子［11］。实验结果表明给药组的TNF α含量显著性降低，说明软骨复合物能通过调控细胞因子的分泌而参与机体的免疫调节。另外，从关节的HE染色可以看出软骨复合物有效减轻小鼠踝关节关节窝的软骨层的病理改变，从而预防了关节炎的产生。

    综上所述，本实验表明软骨复合物对小鼠佐剂性关节炎有显著的预防作用，其机理可能是通过提高机体免疫力，抑制炎性细胞因子的分泌，从而抑制机体炎症反应，是预防类风湿性关节炎发生的新物质，而其对关节炎的治疗作用有待进一步研究。

 

【参考文献】
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［11］ Zhang YH，Heulsmann A，Tondravi MM，et al．Tumor necrosis factoralpha (TNF) stimulates RANKLinduced osteoclastogenesis via coupling of TNF type 1 receptor and RANK signaling pathways［J］．J Biol Chem，2001，276(1)：563-568．

作者：刘颖芬

作者单位：天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457