三种细胞因子对肺纤维化中纤维母细胞转分化的作用

【摘要】  目的 观察大鼠肺纤维化形成过程中TGFβ1、PDGFAA、PDGFBB与肌纤维母细胞的标志物αSMA在不同时间的表达量，探索细胞因子在纤维母细胞转分化为肌纤维母细胞过程中的作用及与肺纤维化程度的关系。方法 气管内注射博莱霉素制备大鼠肺纤维化模型,分别在第7、14、28天处死大鼠取肺组织,应用HE和免疫组化方法观察大鼠肺纤维化程度和四个指标表达的动态变化。结果 造模后纤维母细胞表达αSMA在第7天明显，以后渐降。TGFβ1在第7天表达明显增强，第14天强，第28天明显降低。纤维母细胞和肺泡巨噬细胞表达PDGFAA在第7天强，以后渐降。PDGFBB在纤维母细胞的表达与PDGFAA相似，在肺泡巨噬细胞则第14天强。结论 Fb自分泌TGFβ1、PDGFAA、PDGFBB在其转分化中发挥主要作用。AM是PDGF、TGFβ1的重要来源，在肺泡炎和纤维化持续中发挥重要作用。

【关键词】  细胞因子；肺纤维化；纤维母细胞

　　AEffect of cytokines on the transdifferentiation of
fibroblasts in pulmonary fibrosis

　　SHEN Yuyao,　WANG Jianping,　WANG Yongkang,　DOU Jianming

　　(1. Eepartment of Respiratory Disease; 2. Department of Pathology,  Shandong Provincial Hospital Affiliated to
Shandong University,  Jinan 250021, China)

　　To investigate the TGFβ1, PDGFAA, PDGFBB and αSMA ex[x]pressions at different times on rats with pulmonary fibrosis (PF). Method  The ex[x]pressions of TGFβ1, PDGFAA, PDGFBB and αSMA were determined by immunohistochemical methods. Results  After bleomycin treatment, Fb showed the most positive reaction to antiαSMA on the 7th day, and then it significantly decreased. The ex[x]pression of TGFβ1 continuously increased in the early and middle stages after  bleomycin treatment (714 days), but decreased in the late stage. The ex[x]pression of PDGFAA in Fb and AM was the highest on the 7th day, and then it gradually decreased. The positive staining for PDGFBB in Fb was similar to that of PDGFAA, but AM showed a strong positive staining on the 14th day. Conclusion  TGFβ1, PDGFAA and PDGFBB deriving from autocrine by Fb play primary roles on the transdifferentiation of fibroblasts. AM is an important source of TGFβ1 and PDGF.

　　Key words: Cytokines； Pulmonary fibrosis； Fibroblast

　　纤维母细胞(fibroblast, Fb)是肺纤维化中主要的效应细胞，被活化时可发生功能和表型改变转分化为肌纤维母细胞（myofibroblast, MFb）［2］。该细胞的表型特点在于表达α平滑肌肌动蛋白(αSmooth muscle action, αSMA)［3］,从而具有收缩潜能及较强的胶原合成能力。本研究推测肺纤维化过程中，多种增加的细胞因子可能通过与间充质细胞特定的信息交流,诱导纤维母细胞转分化为肌纤维母细胞参与肺纤维化的形成。目前，国内尚无PDGF、TGFβ1和αSMA在肺组织原位的动态表达变化的研究，因此，本研究借助免疫组织化学方法观察肺纤维化大鼠肺中PDGFAA、PDGFBB、TGFβ1及αSMA的分布、变化及相互关系，进一步探讨肺纤维化机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组 

　　山东大学实验动物中心提供雄性Wistar大鼠36只,体重160～220?g,随机分为2组: 博来霉素(Bleomycin,BLM)组（B组）21只, 水合氯醛麻醉后气管内一次性注入含BLM的生理盐水约0.1?mL(5?mg/kg),注射后立即将动物直立旋转以使药液在肺内分布均匀。对照组(A组）15只,以同样方法气管内一次性滴注约0.1?mL的生理盐水作对照。A、B组于第7、14、28天分别随机处死5只、7只。

　　1.2  观察指标

　　1.2.1  病理学观察 

　　颈椎脱臼法处死大鼠，暴露气管，向大鼠左肺灌注40?g/L甲醛溶液使胸膜展平后将左肺浸入40?g/L甲醛溶液中固定。常规石蜡包埋,切片(4?μm),行HE和免疫组化染色。病理学观察按Szapiel等的方法评价肺泡炎(0～3级)及肺纤维化(0～3级)的程度［4］。0级为0分,1级为1分，2级为2分,3级为3分。

　　1.2.2  免疫组化检测 

　　TGFβ1一抗购自Santa Cruz公司，PDGFBB、PDGFAA、αSMA一抗购自博士德公司。TGFβ1、αSMA采用链霉卵白素-过氧化物酶法 (Streptavidinperosidase,SP法)，PDGFAA、PDGFBB采用抗生物素-生物素-过氧化酶复合物法(AvidinBiotin Peroxidase Complex technique,ABC法),切片常规脱蜡,梯度酒精脱水，去除内源性过氧化物酶,高温高压抗原修复70?min（煮沸后放入切片至冷却取出的时间更长，以获得更高的阳性率）,封闭非特异性抗原,加一抗4?℃过夜。一抗稀释度: TGFβ1和αSMA为1:150，PDGFAA和PDGFBB为1:100。再依次加入二抗、SP/SABC,DAB显色后水洗至少30?min（以获得更干净的背景，下同）。苏木素复染及分化后水洗至少20?min。后，依次脱水、透明、中性树胶封片。
   
　　免疫组化每张切片选取至少20个具有代表性的高倍视野，阳性染色者在细胞浆有棕黄色颗粒沉着。依据染色程度和染色细胞百分率来评定［5］。胞浆未染色者为0分，呈浅棕色为1分，呈棕色为2分，呈深棕色为3分。1～3分的阳性细胞占记数细胞的百分率, 5%以下为0分, 6%～25%为1分,26%～50%为2分, 51%及以上为3分。每张切片的染色细胞百分率和染色程度相乘,所得分数为后得分。0～1分为阴性(-), 2～3分为弱阳性(+), 4～6分为阳性（+

　　2  结  果

　　2.1  形态学定性观察

　　2.1.1  肺大体形态改变 

　　对照组肺呈粉红色,表面光滑,弹性良好。BLM组第7天见密集的点状出血、灶状淤斑,肺体积增大。第14天肺成灰白色,局部见大小不等结节样改变,仍有陈旧出血点。第28天肺成苍白色,体积缩小,硬度增加,表面见结节样及条索状凹沟样改变。

　　2.1.2  HE染色光镜观察 

　　对照组大鼠肺结构清晰,各观察点均未出现明显改变。模型组第7天时肺泡间隔水肿增厚,伴有大量单核巨噬细胞、中性粒细胞为主的细胞浸润,间质内见体积宽大的纤维母细胞增多,病灶内见肺泡萎缩，未萎缩肺泡腔内见中性粒细胞和单核细胞渗出。第14天肺泡间隔明显增宽, 炎细胞浸润较前减少，主要为单核巨噬细胞，见大量椭圆形纤维母细胞，肺泡结构较乱。第28天肺泡壁显著增厚,肺泡结构破坏更明显,间质可见单核巨噬细胞、中性粒细胞和长梭形纤维细胞，肺泡腔内见大量脱落上皮细胞，见图1。

    按Szapiel等的方法评价肺泡炎及肺纤维化的程度，结果见表1。

　　2.2  免疫组化结果 

　　αSMA在正常大鼠的肺支气管平滑肌和血管平滑肌阳性表达，胸膜下偶见弱阳性的纤维母细胞。博来霉素组可见到纤维母细胞胞浆有明显的棕黄色颗粒，且在第7天明显，以后逐渐降低。表1  模型组肺泡炎及纤维化数据分析（略）

　　TGFβ1在正常对照组血管平滑肌及内皮、支气管平滑肌及上皮阳性表达，少量肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophage, AM）及间质内纤维母细胞有弱阳性表达。博来霉素组上述细胞阳性表达增强，增厚的胸膜间皮也阳性表达，细胞外基质及肺泡渗出液亦有弱阳性表达。第7天表达明显增强，第14表达强，第28天随着肺间质明显的胶原沉积TGFβ1的表达明显降低，见图2。
　
　　正常对照组中PDGFAA在血管平滑肌、支气管平滑肌、AM、胸膜间皮弱阳性，血管内皮、支气管粘膜上皮阳性表达。博来霉素组除上述细胞阳性外，可见AM呈阳性或强阳性，间质内Fb也有阳性表达。第7天表达强，以后逐渐降低，至第28天时仅有很弱的表达。PDGFBB阳性定位细胞与PDGFAA相似，但正常组偶见成纤维样细胞弱阳性。在博来霉素组中Fb表达PDGFBB与PDGFAA的动态变化相似。AM表达PDGFBB第7天至第14天持续增强，至第28天明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。免疫组化统计结果见表2、表3。表2  αSMA、PDGFAA在各组的表达（略）表3  PDGFBB、TGFβ1在各组的表达［强度×阳性率（分）］（略）

    不同细胞表达的细胞因子与纤维母细胞表达αSMA量的相关系数：①Fb表达TGFβ1：r＝0.727；② AM表达TGFβ1：r＝0.374；③Fb表达PDGFAA：r＝0.842；④ AM表达PDGFAA：r＝0.878；⑤Fb表达PDGFBB：r＝0.876；⑥ AM表达PDGFBB：r＝0.11。（见图3、图4）

　　3  讨  论

    1971年，Gabbiani等通过电镜从愈合的实验性肉芽组织中发现了肌纤维母细胞，以胞浆出现αSMA为MFb的组织学标志。有关实验表明,肺纤维化时增生状态的Fb其胶原合成与释放并不明显增多,而转分化为MFb后其细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的转录异常活跃,提示MFb是脏器纤维化发生的主要效应细胞［6］，并且发现肺纤维化时增生的MFb在免疫标记、光镜和电镜形态学上具有明显的异质性［7］。2000年后有学者提出器官纤维化病灶内MFb多源性学说,该学说认为,肺纤维化时,除了肺内固有的间充质细胞外,MFb还可能来自外周血(骨髓源性)［89］。新近有文献报道,纤维化病灶内肺泡Ⅱ型上皮细胞也可能通过上皮细胞向间质细胞转变(epithelialmesenchymal transition, EMT)而成为MFb的部分来源［10］。本实验直接标志αSMA避免了其多形性及多源性对观察的影响。通过本实验可见正常肺间隔几乎没有MFb，仅胸膜下偶见αSMA弱阳性的Fb。博来霉素组第7天MFb明显增多，αSMA染色强阳性。以后逐渐降低，但一直高于正常水平。
   
　　TGFβ是促进多种脏器纤维化发生发展的关键因子［11］，其中TGFβ1是重要也是研究多的。近年研究表明，在炎症缓解或组织修复阶段,TGFβ1的表达是受损上皮或实质细胞修复所必须的，但当其过量表达并引起其他细胞生长因子的高表达时引起纤维化［1213］。本实验可见TGFβ1在间质Fb的表达于第7、14天明显增强，第28天明显减弱，与SMA的表达高度正相关。AM表达TGFβ1强于Fb，第28天仍有强表达，与SMA表达正相关，但低度相关。提示Fb自分泌TGFβ1在其转分化中发挥主要作用。而AM是TGFβ1的重要来源，可能是肺间质及支气管上皮中TGFβ1的主要来源。故认为AM在肺泡炎和纤维化持续中发挥重要作用。

    PDGF是1974年在血小板中被发现的, 能刺激间叶来源的细胞分裂、生长,是纤维母细胞的有丝分裂原。目前，发现至少有5种二聚体，研究较多的有3种形式: PDGFAA、PDGFBB及PDGFAB。功能不完全相同,其中PDGFBB在促进结缔组织来源细胞的有丝分裂方面作用可能更强。而且新近研究发现，纤维母细胞所表达的PDGFBB主要以滞留的形式存在,滞留在细胞表面的PDGFBB可对其毗邻细胞发生作用和促进自分泌［14］。本实验可见BLM组中，PDGF在多种细胞染色阳性：在AM强阳性，在Fb阳性，可认为PDGF主要来自AM，并且Fb表达PDGFAA、PDGFBB及AM表达PDGFAA的量与Fb的转分化正相关。可认为Fb自分泌PDGFAA、PDGFBB在其转分化中起主要作用。AM分泌PDGFAA对Fb转分化起协同作用。

    本研究结果还显示，AM分泌PDGFBB和TGFβ1在第14天高，且TGFβ1在第28天仍明显高于正常水平。提示MFb在第14天至第28天的减少速度较前变缓是由于后期AM分泌的生长因子抑制了MFb向成熟的纤维细胞转变，从而导致分泌更多的胶原。而第14至28天TGFβ1持续高表达，结合其减少基质降解的作用，提示这是肺损伤后期纤维化能持续发展的原因之一。

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作者：申玉瑶，王建平，王永康，窦建明

作者单位：山东大学附属省立医院, 1.呼吸科；2.病理科， 济南 250021