EIAV减毒疫苗减毒机制及免疫研究进展

【关键词】 马传染性贫血病毒; 减毒机制; 免疫反应

　　马传染性贫血病（EIA）是由逆转录病毒科慢病毒属的马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）引起的马属动物传染病。以重复发生的病毒血症以及发热, 贫血, 水肿, 血小板减少症和消瘦等临床症状为特点。我国科学家自主研制的EIAV弱毒疫苗是世界上惟一大规模成功应用的慢病毒疫苗, 可以同时活化T细胞免疫与体液免疫。EIAV与HIV（human immunodeficiency virus）同为慢病毒, 两者在病毒形态、 基因组结构、 细胞嗜性、 病毒复制的分子机制、 病毒的生活周期、 抗原漂移规律、 免疫机制及病毒与宿主相互作用等方面都极为相似。深入探索EIAV减毒疫苗相关的免疫保护机制, 将为HIV的新型疫苗的研究提供借鉴。因此, 近年来, 作为慢病毒疫苗研究的一个良好模型, EIAV的感染与免疫受到了国内外学者的重视, 现就减毒疫苗的减毒机制和相关的免疫研究进展加以综述。

　　1 EIAV感染的疾病进程

　　EIAV是慢病毒中基因结构简单的病毒(图1), 感染机体后具有独特的疾病进程和比较明显的病程分界。EIAV主要通过吸血昆虫的叮咬而传播。自然感染的马属动物大部分会经历3个时期, 分别是急性期, 慢性期和无症状带毒期。在感染后2～3周内通常会出现第1次病毒血症。在急性病毒血症后, 大多数动物都进入到慢性感染阶段, 间歇性出现不规律的病毒血症和发热等相关临床症状。在感染后8～12个月, 感染动物进入无症状带毒期［1］。无症状EIAV携带者长期存在, 成为重要的传染源。

　　图1 EIAV病毒基因组结构图（略）

　　2 EIAV减毒疫苗DLV和FDDV的研制与减毒机制

　　在上世纪70年代, 中国研制成功EIAV驴白细胞弱毒疫苗。研制过程经历3个阶段。首先, 分离到的一个毒株在马体内传16代, 得到一个致病性较强的毒株LN40 (GenBank accession no. AF327877)。然后, LN40在驴体内经过133次传代, 一个致病性极强的毒株D510被得到。后, 在驴白细胞上, 经体外120次的连续传代, 获得EIAV驴白细胞弱毒疫苗DLV(GenBank accession no. AF327878)。DLV对马属动物具有良好的保护力。之后, 用同样的体外传代的方法, 将DLV在驴胎皮细胞上传代15次, 获得了比DLV具有更好保护力的驴胎皮细胞减毒疫苗FDDV［2］。DLV很稳定, 动物实验中没有发现毒力的回复, 不仅对同源毒株有保护作用, 而且对异源毒株的攻击也能保护［3］。

　　EIAV的Env一直作为主要的毒力决定基因而受到研究者的重视。和其他慢病毒的膜蛋白一样, EIAV的Env也是病毒与靶细胞受体结合的主要区域, 在病毒与靶细胞吸附、 融合以及侵入过程中, 具有举足轻重的作用［4, 5］。近关于EIAV病毒生物学的研究表明, 细胞质尾截短型的Env蛋白具有诱导细胞凋亡, 并通过线粒体介导细胞坏死的能力［6］。为阐明EIAV减毒疫苗发生毒力减弱的遗传基础, 中国疾病预防控制中心与哈尔滨兽医研究所已经联合将马传贫强毒株(LN40和D510)和减毒疫苗株(DLV和FDDV)进行了全基因克隆测序。通过强毒减弱过程中的序列比对分析, 初步发现减毒疫苗的主要结构基因上发生了若干比较稳定的变异位点（env区10个和gag区3个）。EIAV的包膜蛋白（Env）存在广泛的糖基化, DLV和FDDV与母本强毒株LN40相比, 有数个N糖基化位点的减少。两个减毒疫苗在Env区的10个一致性突变位点中, 有9个定位在gp90区, 一个在gp45区。为了解这些突变的基因对病毒毒力的影响, 研究者首先构建了EIAV减毒疫苗FDDV感染性克隆pFD3。然后, 通过基因工程的方法, 对pFD3的env区的某些一致性突变位点, 分别进行了逆向定点突变以及联合突变包括糖基化位点的恢复, 使其序列由弱毒改变为强毒序列。动物实验表明, Env区多位点的强毒回复突变株诱发了马的EIA症状(体温上升, 并伴有血小板的下降), 而FDDV的感染性克隆毒无EIA的症状［7, 8］。说明了EIAV在体外传代减毒的过程中, N糖基化位点的缺失对于强毒的致弱是有重要作用的。缺失的糖基化位点可能暴露了某些重要的抗原表位, 诱导了更强的免疫反应。

　　另有报道, LTR的变异会改变病毒转录和复制的特性, 导致病毒毒力及细胞嗜性的变化。但是, 用强毒（DLV的母本株）的LTR替换DLV的LTR区的实验研究证实, 单独的强毒的LTR不足以导致EIAV毒力的回复［9］。病毒在体内外不同的细胞中传代致弱的过程中, 有细胞适应性的改变, 在这个过程中, LTR呈现一个逐步进化的改变。LTR的进化使得它出现了新的转录因子结合位点, 导致LTR功能出现某些微调, 使病毒更加适应在不同细胞的微环境中转录与复制［10］。LTR对病毒在致弱过程中的细胞适应有作用, 但是LTR对于EIAV毒力到底有何影响, 还需要进一步阐明。

　　关于S2基因与毒力相关的研究也取得了一定的进展, MONTELARO研究组发现S2基因是高度保守区, 与病毒复制和毒力密切相关。S2缺失的突变毒株在体外复制能力降低, 感染动物的致病性减弱。该研究组因此研制了S2缺失的减毒疫苗［11］。

　　3 EIAV诱导的宿主免疫反应

　　体液免疫: EIAV感染后, 机体会产生针对 Env、 p26等EIAV蛋白的抗体反应。EIAV驴白细胞弱毒疫苗DLV接种马后, 中和抗体约在感染后30～40 d产生, 大约6个月作用成熟［3, 12］, 表现在抗体亲和力和构像依赖性增加。针对gp90, gp45的结合抗体出现较晚, 而针对Gag区p26的结合抗体则出现较早（大约3周作用）, 与HIV感染后各个病毒抗体出现的特征谱相似。上述抗体的检测可以持续1年稳定存在。EIAV减毒疫苗免疫后, 动物攻毒试验结果表明, 获得免疫保护的多数动物体内存在着较高水平的EIAV中和抗体, 提示EIAV中和抗体可能对控制EIAV感染以及疾病进展有一定的作用。

　　EIAV env基因编码病毒粒子前体外膜蛋白, 全长为2 577 bp, 在机体内可被宿主细胞蛋白水解酶水解、 加工成膜表面蛋白gp90和跨膜蛋白gp45。对EIAV包膜蛋白变异的研究确定了8个多变区域。变异区分别命名为V1V8(图2), 其中V3区是EIAV的高度变异区, 存在主要的中和表位区(PND)。目前已确定2个中和表位ENT和DNT在V3区［13］。ElAV抗原的变异可以引起病毒PND变异, 从而引起病毒的免疫逃逸。研究表明, 病毒感染后在不足1个月的时间内, 就可检测到env基因的突变发生。env基因的变异导致了氨基酸的替代, 缺失以及潜在的N连接的糖基化位点的改变。这些改变有可能改变蛋白的空间构象, 遮蔽抗原表位, 减弱或消除中和反应。一旦中和逃逸株出现, 病毒又重新复制, 扩增, 导致新的病毒血症或EIA的重现, 机体也相应地产生新的中和抗体来阻断病毒感染细胞, 遏制感染的扩散。因自然感染后中和抗体产生的时间较晚, 因而, 对于控制急性期病毒血症, 主要依靠天然免疫和细胞免疫的作用, 中和抗体的作用可能比较局限。但在感染后1年内中和抗体的持续存在, 对于控制疾病进展也许具有一定的意义。

　　图2 EIAV包膜蛋白的gp90区（略）

细胞免疫: 在EIAV感染早期, 病毒突破宿主的天然免疫屏障, 激发起获得性免疫反应。EIAV减毒疫苗的细胞免疫反应研究表明, 在减毒疫苗DLV免疫后, T淋巴细胞的亚群分布出现变化, CD8+细胞数明显增加, CTL的杀伤效果在免疫后6个月时达到30％以上［14］。而且, DLV免疫马3周后, 外周血PBMC IFNγ、 IL2的表达量显著高于健康对照组及自然感染组, 持续至32周以上。EIAV强毒攻毒后, DLV免疫马均未出现发热等马传贫症状, 获得完全保护, 其体内细胞因子水平继续升高, 在攻毒后6～10周达到高峰。而对照马在攻毒后分别在2～3周就开始出现急性或亚急性马传贫病的临床反应, 经历几次间歇发热后, 终死亡, 死亡马体内IFNγ、 IL2表达水平, 均低于DLV免疫马几个数量级, 且在发热时伴随明显的病毒载量升高。说明DLV诱导的高水平Th1型细胞因子IFNγ、 IL2和IL12, 与DLV的免疫保护具有相关性, 在抵抗EIAV感染中发挥重要作用［15］。

　　McGuire等详细研究了gag和pol区的Th和CTL反应, 但对env区的与保护性免疫相关的细胞免疫反应仅有有限的认识［16, 17］。近, Tagmyer等［18］报道了在EIAVpv病毒的env区的6个CTL表位和17个Th表位。T细胞对抗原表位的识别是受MHC限制的, 不同的MHC对这些表位的识别是有差异的, 因此, 在不同MHC的马中评估细胞免疫的作用, 多种表位的刺激是必须的。这些表位的确定为详细分析细胞免疫在减毒疫苗保护中的作用打下基础。

　　已经证实有严重联合免疫缺陷的马不能控制EIAV感染后的病毒血症。这些免疫缺陷马是T细胞和B细胞双重缺陷, 但是在输入了事先被EIAV刺激的同源马的淋巴细胞后, 这些缺陷马又获得了控制病毒血症的能力［19］。说明EIAV特异性的免疫在控制感染的过程中有重要作用。对于初次病毒血症的控制, CTL是与之相关的, 因为中和抗体是在初次病毒血症控制后出现的。

　　EIAV包膜蛋白的变异程度对疫苗保护性的影响, 在S2基因改造疫苗上, 已经有了明确的实验数据的支持。Craigo等［20］证实Env蛋白的氨基酸变异程度与S2基因改造疫苗的保护性成负相关, 随着Env蛋白的变异程度的增大, 疫苗的保护率下降。但是对于中国的DLV以及FDDV减毒疫苗没有这样的实验数据的支持, 尽管中国减毒苗可以保护住异源毒株的攻击［3］。

4 结语

　　目前以EIAV减毒疫苗为基础的新型HIV疫苗的抗原改造研究正在进行中, 小鼠试验的初步结果证明改造后抗原的免疫原性有提高。通过对中国EIAV减毒疫苗的减弱机制以及保护性免疫的深入研究, 将会对包括HIV在内的其他慢病毒疫苗研究提供更多的科学借鉴。

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