骨折合并脑外伤时骨愈合过程中神经生长因子作用的研究

张华 马维 牛彦平 作者单位：石家庄市，河北医科大学第二医院

　　【摘要】 目的 通过对脑外伤骨愈合过程中神经生长因子(NGF)合成变化的观察,探讨其在此过程中的作用，以此加深对骨生理学的认识，同时为干预骨愈合提供理论依据。方法 72只大鼠随机分为正常组对照(N)组6只，脑外伤(TBI)组6只，骨折(F)组30只，骨折合并脑外伤(TBI+F)组30只。建立大鼠脑外伤模型，通过组织学观察及酶联免疫吸附法，研究骨折合并脑外伤时血清中NGF含量的变化。结果 N组血清NGF OD值为0.041，F组手术后第3天血清NGF略有升高，1周时为高，然后开始下降，4周时降至正常。TBI组和TBI+F组术后第3天血清NGF明显升高， 1周后开始下降，5周时降至正常;其与TBI组或F组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 NGF对促进骨质愈合可能有重要作用。

　　【关键词】 神经生长因子;骨折愈合;脑外伤

　　【Abstract】ob[x]jective To observe the changes of levels of nerve growth factor (NGF) during bone healing in fracture combined with traumatic brain injury,and to investigate its effect during the process in order to deepen the understanding for bone physiology, and to provide a theoretical basis for intervention of bone healing.Methods 72 rats were randomly divided into normal control group (group N,n=6),traumatic brain injury group(TBI group,n=6),fracture group(group F,n=30), fracture combined with brain trauma group(TBI+F group,n=30).The models of traumatic brain injury in SD rats were established,and histological observation and ELISA were used to observe the changes of NGF levels in serum during fracture combined with brain trauma. Results The serum OD value in NGF group was 0.041,the levels of serum NGF in group F were slightly increased at 3 days after surgery, which would reach peak at one week after surgery,then which gradually decreased and reached normal levels on the 4th week. The NGF levels in TBI group and TBI+F group at 3 days after surgery increased obviously,which began to decrease at one week after surgery and reached normal levels on the 5th week,there were significant differences in the NGF levels between TBI+F group and TBI group or group F(P<0.05).Conclusion NGF may play an important role in promoting bone.

　　【Key words】nerve growth factor; fracture healing; traumatic brain injury

　　神经因素在骨折愈合过程中具有重要作用，它们可以调节骨折修复过程中的多种反应，影响细胞增殖、迁移和释放。神经因素，特别是神经肽、神经生长因子(NGF)的变化，将直接影响骨折愈合过程。本研究通过组织学观察及酶联免疫吸附法，研究骨折合并脑外伤时血清中NGF含量的变化，探讨脑外伤时骨折愈合加速的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与分组

　　清洁级成年雄性SD大鼠72只，体重350～400 g，合格证号：DK04090046，许可证号：SCXK(冀)20031003，由河北医科大学实验动物中心提供。大鼠NGF定量EIA试剂盒由上海森雄科技实业有限公司生产。速眠新Ⅱ注射液由长春军需大学兽医研究所提供。OHBA SIKI打击器由Tokyo公司,日本生产。采用随机数字表方法，将大鼠分为4组：正常对照(N)组6只;脑外伤(TBI)组6只;骨折(F)组30只;骨折合并脑外伤组(TBI+F)组30只。

　　1.2 模型制作

　　大鼠称重，按1 ml/kg给予速眠新Ⅱ肌内注射麻醉，显露颅顶骨，使用OHBI SIKI打击器，按Gruner改良法制作中度脑损伤模型(将400 g砝码于100 cm高处通过导管坠落，撞击置于人字缝与失状缝之间的圆锥上，致中度脑损伤)，充分显露一侧胫骨后，在胫骨结节下1 cm处横断胫骨，以直径1 mm的克氏针作髓内固定。骨折组完成骨折模型后，仅显露颅顶骨，不作打击。TBT组完成中度脑外伤模型后，仅显露胫骨，不折断胫骨。N组不作任何处理。术后所有伤口用碘伏消毒，并用庆大霉素冲洗。术毕分笼饲养。

　　1.3 标本采集

　　N照组于实验开始后第1周采集内眦静脉血2 ml，离心后取血清于-20℃贮存待测。F组、TBI+F组及TBI组分别于术后第3天、第1、2、3、4、5周各取6只采集内眦静脉血2 ml，离心后取血清于-20℃贮存待测。

　　1.4 血清NGF含量的测定

　　用大鼠NGF定量EIA试剂盒，加酶标抗体工作液，完成后在492 nm处测吸光值。所有OD值减除空白值后再行计算。

　　1.5 骨标本处理

　　摄取X线片后取右胫骨全长，经固定、脱钙、常规石蜡包埋，用LEICA RM2125石蜡切片机进行连续石蜡切片，厚6 μm。分别用于HE 染色。

　　1.6 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以 ±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 组织学观察

　　2周前观察骨折间无骨痂生长，仅见纤维连接。F组术后第4周断端间少量小灶性软骨岛，其中软骨细胞肥大、退变，断端间出现较成熟的骨小梁;第5周断端间由大量较成熟骨小梁连接，有部分板层骨形成，仅见少量肥大、退变的软骨细胞。TBI+F组术后第4周断端间由大量较成熟的骨小梁连接，仅见少量散在的软骨细胞肥大、退变;第5周断端间基本由板层骨连接，其间血管丰富，已不见纤维和软骨成分，F组术后第3周有骨痂形成，量较少，断端间骨折线较清晰;第5周骨折线模糊，仍隐约可见。TBI+F组术后第3周有较多骨痂形成;第5周骨折线已消失。

　　2.2 血清NGF含量

　　N组血清NGF OD值为0.0402，F组手术后第3天血清NGF略有升高，第2周时为高，然后开始下降。TBI组和TBI+F组术后第3天血清NGF明显升高， 1周后开始下降，5周时降至正常;TBI组与F组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。

　　3 讨论

　　在临床实践中人们发现截瘫和颅脑损伤的患者伴随着的四肢骨折往往可以见到大量的骨痂过度生长，甚至肌肉中出现异位骨化，骨折愈合明显快于没有中枢神经损伤的四肢骨折患者。

　　Feeney于1968年报告脑外伤后出现异位骨化现象，后许多学者对骨折合并脑外伤患者的骨愈合和异位骨化进行了研究。Spencer研究发现伴有脑外伤的患者骨折愈合过程中出现大量骨痂，骨折愈合加快。本组结果也显示TBI+F组在骨折愈合过程中产生更多的骨痂，骨折愈合加快。

　　Schuijers等用NGF治疗鼠肋骨骨折，发现局部应用NGF后，可使骨痂生成增多，骨痂的刚度和抗折弯强度增加，提示局部注射NGF可促进骨折愈合。Grills等通过对大鼠肋骨骨痂的生物力学性能、儿茶酚胺浓度、组织形态计量和骨痂大小的测量证实原来认为主要作用于神经系统的NGF，对骨折愈合也有促进作用。同时在骨痂中的骨祖细胞、成骨细胞等可产生NGF，NGF可诱导交感神经和感觉神经纤维长入骨痂，这些神经纤维可释放神经递质。周海斌等发现颅脑外伤后血清存在促进人骨髓基质干细胞分化、增殖的物质。刘宇鹏等对大鼠的研究结果显示NGF对正常骨组织的神经维持有重要作用,对骨折的修复通过神经系统起促进作用。1987年Perkins和Srirving通过对22例合并脑损伤及22例无脑损伤股骨干骨折髓内钉固定术后骨折愈合的对比性研究，发现脑外伤合并骨折患者骨折处骨痂量显著增加，并且愈合时间平均缩短了4周。Spencer 通过对53例肢体骨折合并重度脑损伤与30例无脑损伤长管状骨骨折的对比性研究得出了相似的结论。黄煌渊等综合文献后认为脑外伤刺激成骨反应、加速骨折愈合的机制可能是机械刺激和激素作用。

　　本实验中大鼠胫骨骨折均以克氏针做髓内固定，排除了机械因素的影响。结果发现组织学观察TBI+F组较N及F组骨痂生长快，TBI+F与TBI组血清NGF含量升高程度明显大于F组(P<0.05)，这可能与脑外伤后NGF释放有关。这与血清中NGF含量有一定的相关性。血清学结果示第5周后TBI+F与F组比较差异无统计学意义(P>0.05)， TBI+F组血清NGF含量较TBI组升高(P<0.05)，说明随受伤情况好转NGF的含量也呈一定的下降。综合比较本实验结果分析，脑外伤后骨折愈合加速与脑外伤后血清中NGF含量增加有直接的关系，可直接促进骨折局部表达，从而促进骨折愈合。

　　综上所述，在脑外伤后血清中NGF含量升高，可能是由于脑外伤造成NGF的合成增多。成骨细胞在受到NGF的影响后，开始自身的增殖，从而加速骨折愈合。骨折后机体出现协调的愈合过程，其中包括多种组织细胞、细胞因子之间错综复杂的网络作用。神经因素在骨折愈合过程中具有重要作用，它们可以调节骨折修复过程中的多种反应，影响细胞增殖、迁移和释放。神经因素，特别是神经肽、NGF的变化，将影响骨折愈合过程。总之，在脑外伤后，由于各种因素的参与，加速了骨折的愈合机制，NGF在其中起到了重要作用。

　　【参考文献】

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　　3 Perkins R, Skirving AP. Callus formation and the rate of healing of femoral fractures in patients with head injuries. J Bone joint Surg, 1987, 69: 521524.

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　　7 刘宇鹏.神经生长因子在大鼠胫骨骨折中的表达.中国临床康复,2006,10：107.

　　8 黄煌渊,张权，张义，等.合并颅脑外伤昏迷者的骨折愈合及其治疗时机选择.骨与关节损伤杂志，1999, 14: 297299.