骨髓腔内注射造血干细胞移植的研究和应用进展

作者：蔡耘,黄绍良　　作者单位：中山大学附属第二医院儿科，广州 510120

　　【摘要】骨髓腔内注射造血干细胞移植旨在促进HSC的归巢。近年来已有大量的动物实验肯定了不同来源供体细胞通过骨髓腔内注射能有效地归巢并植入骨髓、迅速重建受体造血和免疫功能、减少GVHD，诱导同种异基因器官移植免疫耐受，提高受体生存率。本文主要对该技术在骨髓移植、脐血移植、研究HSC生物学特性等方面的作用以及临床应用前景进行综述。

　　【关键词】 骨髓腔内注射

　　Abstract The purpose of hematopoietic stem cell transplantation by intra-bone marrow injection (IBM-HSCT) is to facilitate the homing of HSC. It has been recently proven in many animal experiments that different kinds of donor cells could efficiently home and engraft into the bone marrow by IBM-HSCT，which led to the rapid hemopoietic and immune recovery of recipients，preventing the development of GVHD，inducing the donor-specific tolerance in allogeneic organ transplantation，and promoting the survival rate of recipients. In this review，the effect of IBM-BMT and IBM-UCBT，the application of IBM injection technique in the study on HSC′ s biological characteristics，and its prospect for clinical HSCT were sumarized.

　　Key words intra-bone marrow injection;hematopoietic stem cell transplantation;bone marrow transplantation;cord blood transplantation

　　造血干细胞移植 ( hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)经过40余年的临床应用，已成为能够治愈血液病、实体瘤、遗传代谢性疾病、自身免疫性疾病等多种疾患的安全有效的治疗手段，其进一步发展尚依赖于诸多因素，如探索HSC的佳来源和输注途径，对HSC及其相关细胞因子生物学特性的进一步研究，预处理方案的优化以及对移植相关并发症的预防和处理等等。新的理论和移植技术层出不穷，其中旨在促进HSC归巢的骨髓腔内注射(intra-bone marrow injection，IBMI)技术，自2001年Kushida等[1]提出后，随着动物实验有效性的报道不断增多，已向我们展示出它对HSCT的重要作用和广阔的临床应用前景。

　　经外周静脉输注HSC的归巢以及

　　对HSCT的影响传统HSC输入途径为经外周静脉输注，该技术已广泛应用于临床HSCT与相关基础研究中。以此法输注的HSC须先经右心房、右心室、肺部进入体循环，在4小时内根据血流量的不同进入骨髓、肝、脾、肺、骨骼肌及其它组织中，但绝大部分滞留于肺部，仅有少量HSC能在某些细胞因子(如SDF-1及其受体CXCR4等)的影响下识别相应的血管位点并穿越基底层到达骨髓腔。这一特异且迅速的过程称为HSC“归巢”(homing)，一般在移植后12-36小时内完成。只有归巢并定居于骨髓微环境中合适“龛位”(niche)的HSC才能进一步增殖、分化和重建造血[2]。有研究发现移植后3小时仅有(5.6±0.7)%的供体细胞到达骨髓腔[3]。Yahata等[2]将PKH-26标记的人脐血CD34+细胞经尾静脉输入经60Co亚致死量照射后的NOD/SCID小鼠，发现移植后20小时受体骨髓腔中的供体细胞只占其骨髓细胞总数的 (1.56 ± 0.32)%。 经外周静脉输注的HSC如此低的归巢比例无疑将明显影响其植入效率。由van-der-Loo等[4]所进行的小鼠同种异基因 HSCT中，骨髓和脾脏的种植效率分别为18% -20%和8% -10%。在异种移植中该比例更低，据Cashman等[5]报道，人脐血HSC植入亚致死量辐照的NOD/SCID小鼠的效率为7%。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2006;14(1)骨髓腔内注射造血干细胞移植的研究和应用进展为减少HSC在受体骨髓外器官组织的滞留而造成的损失，国内外学者曾尝试HSC的其他注射途径。如刘英等[6]将人脐血MNC直接注入胚胎卵黄囊内进行SD大鼠宫内移植，植入率为89.7%，未发生GVHD。这一结果提示胚胎对异体抗原的反应表现为免疫耐受，外源性HSC卵黄囊内移植能更早地与受体HSC竞争，产生更高的嵌合比例;Fan等[7]发现，经门静脉注射(portal vein injection，PV injection)的HSC在7天内迁移至造血、免疫器官，移植后第3天和第7天肝脏、骨髓和胸腺中供体源细胞明显高于尾静脉注射组(i.v组)。PV组67%的小鼠可存活40天以上，i.v组小鼠则在23天内全部死亡，提示HSCT门静脉注射途径可有效地重建造血和免疫，提高受体存活率。显然以上方法都因技术操作难度大、设备条件限制不易于临床的应用和推广。近年来的动物实验研究提示，具有较长临床应用历史的骨髓腔内输注技术可能是一种安全、有效的HSC输注手段。

　　骨髓腔内输注的理论基础与临床应用

　　位于长骨骨髓腔和扁骨松质骨骨小梁中的骨髓含有丰富的血管，某些小血管的管壁变薄、管腔扩大成为血窦，骨髓腔内充满网状的海绵状静脉窦。长骨和扁骨骨髓腔中的静脉窦汇集成一至数条大的静脉沿动脉径路出骨后汇入静脉干。骨髓腔内静脉窦一定程度的开放状态和高通透性是骨内输液的解剖学基础，控制输注速度和浓度既能提高局部药物浓度又能使输入的药物和液体有效地进入全身血液循环，成人输液速度可达20 -50 ml / min。骨穿刺部位宜选四肢长骨尤其是胫骨近端，骨质较硬者可采用胫骨中部稍上方处。髂骨、胸骨、锁骨均不如四肢长骨操作方便和成功率高。并发症少见，多为液体渗漏皮下或骨膜下、继发感染、骨筋膜室综合征、脂肪栓塞等[8]。

　　由于静脉输液导管类型和质量的改进，20世纪40年代后期骨髓腔输液已很少用于常规治疗，而多用于急症抢救时建立输液通路和某些疾病的特殊治疗。傅美珍等[9]单用超小剂量阿糖胞苷(8-10毫克/次，每周1次)骨髓腔内注射治疗2例成人急性非淋巴细胞白血病(M2型)，分别于51天、57天获得完全缓解。Sesay等[10]在脊椎整形术中以利多卡因椎骨腔注射联合纳布啡、丙帕他莫静脉推注，麻醉有效率与单纯静脉用药组相当(85 % vs 84%)，但副作用的发生率少75%，利多卡因血浆浓度仅为中毒剂量的1/4。还有骨髓腔内用药成功治疗再生障碍性贫血、创伤性骨髓炎等疾病的报道，但至今尚无骨髓腔内注射HSCT的临床研究资料。

　　骨髓腔内注射HSCT的实验研究现状

　　骨髓腔内注射HSCT的直接目的是增加HSC的归巢。但已有研究证实，经骨髓腔内输注的药物可迅速地弥漫到静脉窦，从骨髓到动脉与从静脉到动脉的循环时间一致。但直接注射入骨髓腔中的HSC是否能及时、有效地植入“龛位(niche)"并增殖分化、重建受体造血免疫功能，IBM输注途径对受体免疫功能的恢复及GVHD有何影响，鉴于骨髓腔穿刺可能增加病人的痛苦和继发感染的机会，该方法是否有肯定的临床应用价值等问题都需要深入探讨。目前对这一技术的研究成果主要是在动物实验的基础上改进和完善其具体操作方法，并已通过一系列的动物模型验证其有效性。

　　骨髓腔内注射骨髓移植(IBMI-BMT)

　　虽然IBMI在临床上是非常成熟、安全的技术，但对于实验动物，尤其是啮齿类小动物则不易操作，从而限制了对此技术的深入研究。近年来，日本关西医科大学Ikehara领导的研究小组对动物骨髓液的采集、IBMI的方法做了部分改进，其可操作性大为提高。Ikehara小组以长骨灌流法(perfusion me- thod)采集骨髓，IBMI则以受鼠长骨(如胫骨、股骨)为穿刺部位，行约5 mm皮肤切口，持50 μl或1 ml微量注射器以26-29 G针头自膝关节表面穿过膝腱插入骨髓腔。每只受鼠注射供体细胞数为5×106-3×107 BMC，注射液容量为3.5-40微升/每侧胫骨腔。Ikehara小组已建立了小鼠、大鼠、家兔及食蟹猴等多种移植动物模型。

　　现有研究资料表明，IBMI-BMT单独或与其它方法联合运用能明显提高供体细胞植入效率，促进受体造血、免疫功能的重建。Kushida等[1]应用IBMI技术，以正常C57BL/6小鼠为供体对狼疮性肾炎MRL/lpr小鼠行异基因骨髓移植，发现IBMI组移植后3天供体源性骨髓细胞在受体注射侧及非注射侧胫骨骨髓中均占60%，脾脏中占40%，移植后10天在上述部位几乎达到，而i.v组移植后3天供体源性细胞在骨髓中<10%，移植后10天为70%。IBMI组所有受鼠的无病生存期超过1年，原有的异常T细胞(Thy1.2+/B220+/CD4-/CD8-)消失，混合淋巴细胞培养及抗绵羊红细胞抗体生成实验证实受体具有正常的免疫功能;2004年Nakamura等[11]报道，将骨髓腔内注射细胞浓度提高至5×106/3.5 μl，行双侧胫骨注射并联合供体外周血单个核细胞(PBMNC)静脉输注(DLI)，平均于BMT后7天植入并成为完全供体型，受鼠达到长期存活(>120天);Zhang等[12]则进一步比较骨髓造血细胞联合基质细胞骨髓腔内输注或静脉输注及单纯骨髓造血细胞骨髓腔内输注的移植效果，发现两种细胞同时骨髓腔内注射可以更好地促进供体细胞在受体内的造血、免疫重建。

　　在实质器官移植中，IBMI-BMT亦起到良好的诱导免疫耐受的作用。Esumi等[13]将受体BN大鼠予氟达拉宾+亚致死量60Co辐照预处理，24小时后移植F344大鼠后肢并接受其骨髓细胞IBMI。在不予免疫抑制剂的情况下观察一年，全部受鼠存活，移植肢体均未出现排斥反应，而且供体细胞能完全重建造血。

　　Ikehara[14]认为IBMI-BMT有以下优势：①GVHD罕见，即使供体细胞中含有一定量的T细胞(<6%)亦无GVHD发生;②植入率高，即使预处理照射剂量低于亚致死量也可移植成功;③造血重建快;④T细胞的功能可以完全恢复。IBMI-BMT的有效性与其促进骨髓HSC与基质细胞的归巢密切相关：①经骨髓腔注射的HSC可在注射及非注射部位的骨髓和其它造血器官中迅速达到佳的分布。② IBMI-BMT可以有效地使供体骨髓基质细胞进入受体受损的骨髓微环境中支持造血。同时这些基质细胞可通过直接包绕HSC或分泌具免疫抑制作用的肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子β(TGF-β)等细胞因子使HSC免受免疫活性细胞的攻击，还可经血循环进入胸腺参与T细胞的阳性选择而促进T细胞免疫功能的恢复。③灌流法(PM)能避免传统髂骨多点穿刺抽取法所造成的外周血(如CD4+、CD8+T淋巴细胞)混入，因此减少甚至避免了GVHD的发生，而PM法采集的HSC活性亦高于传统方法。

　　骨髓腔内注射脐血移植(IBMI-UCBT)

　　脐血移植(UCB transplantation，UCBT)已经成为可替代BM-HSCT的重要治疗手段。但由于单份UCB所含HSC数量有限并更为幼稚，免疫效应细胞功能不成熟，以致UCBT后造血、免疫重建延迟，感染率、移植相关死亡率较高，在一定程度上影响和限制了UCBT的发展应用。有希望解决UCBT造血恢复延迟的策略包括通过体外扩增、混合脐血移植等方法增加UCB中HSC的数量，以间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)与造血干细胞联合移植以促进供体HSC归巢骨髓并迅速增殖等。其中，促进UCB中有限的HSC归巢并植入骨髓是目前研究的热点之一。

　　已有动物实验证实IBMI-UCBT同样能促进HSC归巢，提高植入效率。Wang等[15]将人脐血CD34+细胞2×104-2×105/40 μl注入NOD/SCID小鼠胫骨骨髓腔中并做限制性稀释法分析供体细胞的植入频率，发现IBM组人脐血Lin-/low CD34+CD38-细胞的植入频率为1/44，而i.v组仅为1/660。移植后在外周血、脾脏及非注射侧胫骨骨髓腔内均检出该供体细胞并能够分化，提示骨髓内移植有正常的归巢和种植机制。取出移植后6周的小鼠骨髓内人CD45+细胞进行第2次静脉或骨髓内注射，IBMI组与i.v组的供体嵌和比例分别为0.546±0.268 、0.031±0.018(P<0.01);

　　Castello等[16]报道，将IBMI组输注的人脐血细胞数减少1/2，于移植后30、60、90天与i.v组比较受体内人CD45+细胞和CD45+/CD34+细胞含量，两组无明显差异。可见IBMI法具有更高的移植效率，尤其在UCBT输注细胞数有限的情况下更具有应用价值。

　　对于其它来源的HSC，如小鼠胚胎干细胞R1诱导分化的HSC，骨髓腔内注射亦较静脉输注有明显的优势。

　　骨髓腔内注射在HSC生物学特性研究中的作用

　　IBMI技术除了可应用于不同来源造血干细胞移植实验，还可广泛用于有关HSC的基础研究。例如CD34- HSC由于归巢相关受体表达水平较低而缺乏SDF-1/CXCR4介导的归巢能力，以传统静脉输注途径移植无法重建受体的造血免疫功能，因此难以研究其生物学特性。为排除归巢的影响，Kimura等[17]将人脐血Lin-CD34-细胞直接注射入经60Co亚致死量照射的NOD/SCID鼠胫骨骨髓腔中，可使供体细胞成功植入。与CD34+细胞相比，该群细胞在受体内的分化、造血重建虽较迟缓，但具更高的增殖和迁移潜能，属于原始的HSC，有更好的同质性(homogenous nature);Zhong等[18]则以股骨骨髓腔内注射的方法比较供体骨髓细胞在清髓或非清髓受鼠体内的再分布和增殖情况，结果显示预处理方式对移植细胞的骨髓内再分布无明显影响，供体细胞在非清髓受体中植入率低的主要原因是无法有效扩增，而不仅仅是“龛位”的缺乏。

　　骨髓腔内注射HSCT的临床应用前景

　　以上的动物实验验证了骨髓腔内注射能够通过促进HSC迅速有效的归巢和植入骨髓来提高HSC的移植效率，因而有可能应用于临床HSCT。但有关于IBM-HSCT的临床研究资料却极少。1998年Hagglund等[19]曾报道38例(年龄≥18岁)接受HLA全相合或1个位点不合的血缘相关骨髓移植，骨髓腔滴注(IBM-drop infusion，IBM-drop)、i.v+IBM-drop和i.v组分别有8、10、20例，结果ANC≥0.5×109中位时间分别是20、19、18.5天，IBM-drop组依赖静脉营养和使用抗生素的时间明显少于i.v组，而3组病例在急性和慢性GVHD发病率、移植相关死亡率、复发率及生存率方面无明显差异。2003年Ikehara等[14]对此结果进行回顾分析，认为除了骨髓采集方法的影响外，Hagglund等[19]采用的髂骨骨髓腔滴注法容易使供体细胞过快地进入外周血循环而不是停留于骨髓内，因此不能达到佳的注射效果。而目前的研究仍缺乏从临床角度探讨骨髓腔内注射的佳治疗策略，如注射剂量、部位、速度等。

　　综上所述，大量的动物实验肯定了不同来源供体细胞通过骨髓腔内注射途径能有效地归巢并植入骨髓，达到迅速重建受体造血和免疫功能，减少GVHD，诱导同种异基因器官移植免疫耐受，提高受体生存率的目的。这一技术值得进一步进入临床移植研究和深入探讨。

　　【参考文献】

　　1Kushida T，Inaba M，Hisha H，et al. Intra-bone marrow injection of allogeneic bone marrow cells: a powerful new strategy for treatment of intractable autoimmune diseases in MRL/lpr mice. Blood，2001;97: 3292-3299

　　2Yahata T，Ando K，Sato T，et al. A highly sensitive strategy for SCID-repopulating cell assay by direct injection of primitive human hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood，2003;101: 2905-2913

　　3Szilvassy SJ，Meyerrose TE，Ragland PL，et al. Differential homing and engraftment properties of hematopoietic progenitor cells from murine bone marrow，mobilized peripheral blood，and fetal liver. Blood，2001;98: 2108-2115

　　4van-der Loo JC，Ploemacher RE. Marrow- and spleen-seeding efficiencies of all murine hematopoietic stem cell subsets are decreased by preincubation with hematopoietic growth factors. Blood. 1995;85: 2598-2606

　　5 Cashman JD，Eaves CJ. High marrow seeding efficiency of human lymphomyeloid repopulating cells in irradiated NOD/SCID mice. Blood，2000;96: 3979-3981

　　6刘英，庄广伦，游泽山等. 人脐血造血干细胞经鼠卵黄囊进行宫内移植的实验研究. 中华医学杂志，2003，83: 60-62

　　7Fan TX，Hisha H，Jin TN， et al. Successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT) by injection of bone marrow cells via portal vein: stromal cells as BMT-facilitating cells. Stem Cells，2001;19:144-150

　　8孙崇启.婴儿应用急救药物的静脉替代途径. 临床儿科杂志，1995;13:376-377

　　9傅美珍. 超小剂量阿糖胞苷骨髓腔内注射治疗急性非淋巴细胞白血病2例. 中国实用内科杂志，1997;17: 733

　　10Sesay M，Dousset V，Liguoro D， et al. Intraosseous lidocaine provides effective analgesia for percutaneous vertebroplasty of osteoporotic fractures. Can J Anaesth，2002;49: 137-143

　　11Nakamura K，Inaba M，Sugiura K，et al. Enhancement of allogeneic hematopoietic stem cell engraftment and prevention of GVHD by intra-bone marrow bone marrow transplantation plus donor lymphocyte infusion. Stem Cells，2004;22: 125-134

　　12Zhang Y，Adachi Y，Suzuki Y， et al. Simultaneous injection of bone marrow cells and stromal cells into bone marrow accelerates hematopoiesis in vivo. Stem Cells，2004;22: 1256-1262

　　13Esumi T，Inaba M，Ichioka N，et al. Successful allogeneic leg transplantation in rats in combination of intra-bone marrow (IBM) injection of donor bone marrow cells. Transplantation，2003;76: 1543-1548

　　14Ikehara S. A novel strategy for allogeneic stem cell transplanta- tion: perfusion method plus intra-bone marrow injection of stem cells. Exp Hematol，2003: 1142-1146

　　15Wang J，Kimura T，Asada R，et al. SCID-repopulating cell acti- vity of human cord blood-derived CD34- cells assured by intra-bone marrow injection. Blood，2003;101:2924-2931

　　16Castello S，Podesta M，Menditto VG，et al. Intra-bone marrow injection of bone marrow and cord blood cells: an alternative way of transplantation associated with a higher seeding efficiency. Exp Hematol，2004;32: 782-787

　　17Kimura T，Wang J，Matsui K，et al. Proliferative and migratory potentials of human cord blood-derived CD34- severe combined immunodeficiency repopulating cells that retain secondary reconstituting capacity. Int J Hematol，2004;79:328-333

　　18Zhong JF，Zhan Y，Anderson WF，et al. Murine hematopoietic stem cell distribution and proliferation in ablated and nonablated bone marrow transplantation. Blood，2002;100: 3521-3526

　　19Hagglund H，Ringden O，Agren B，et al. Intraosseous compared to intravenous infusion of allogeneic bone marrow. Bone Marrow Transplant，1998;21:331-335