骨髓增生异常综合征患者线粒体DNA Dloop区突变研究

作者：靳红,丛雅琴,胡晓静,姜育杰　　作者单位：山东大学齐鲁医院血液内科， 济南 250012

　　【关键词】骨髓增生异常综合征,DNA,线粒体,突变;单核苷酸多态性

　　To investigate mitochondrial DNA mutation in myelodysplastic syndromes. Methods The mtDNA of 42 patients with myelodysplastic syndromes was extracted from both bone marrow and buccal epithelial cells. Hypervariable regions (HV1 and HV2)in the Dloop of the mtDNA were amplified by PCR, and then were sequenced. Results Nineteen mutations in the Dloop region were found in 6(14.29%) MDS cases. Five microsatellites were unstable, and the others were point mutations. Conclusion Mutations in the Dloop region of mitochondrial DNA were found in MDS patients and they might play an important role in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes.

　　Key words： Myelodysplastic syndromes; DNA, mitochondrial; Mutation; Polymorphism

　　通过直接测序法对基因序列进行检测，从而探讨mtDNA突变在MDS发生发展中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 初诊的MDS患者42例，其中男17例，女25例，25～62岁(中位年龄51岁)。样本来自2006年10月至2007年4月山东大学齐鲁医院门诊和住院MDS患者的骨髓和口腔上皮细胞。其中难治性贫血(refractory anemia，RA)患者21例，环形铁粒幼红细胞性难治性贫血(refractory anemia with ring sideroblast，RARS)患者2例，难治性血细胞减少伴多系增生异常(refractory cytopenia with multilineage dysplasia， RCMD)患者7例，难治性贫血伴原始细胞增多1(refractory anemia with excess blasts1，RAEB1)患者2例，难治性贫血伴原始细胞增多2(refractory anemia with excess blasts2，RAEB2)患者10例。

　　1.2 仪器与试剂 PCR仪为德国eppendorf公司产品，TaqDNA聚合酶购自上海博亚生物技术有限公司，口腔试子基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒购自北京天根公司。纯化后的PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

　　1.3 方法

　　1.3.1 基因组DNA的提取 收取患者骨髓标本2～3?mL，3.8%枸橼酸钠抗凝，同时收取患者口腔上皮细胞。酚-氯仿法抽提骨髓基因组DNA，三甲基氯基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)溶解DNA，-80?℃保存备用。口腔试子基因组DNA提取试剂盒提取取口腔上皮基因组DNA。

　　1.3.2 聚合酶链反应扩增线粒体DNA 引物序列设计如下：HV1区上游引物：5′TAACTCCACCATTAGCACC3′，下游引物：5′ATTGATTTCACGGAGGATG3′，扩增片段长度468?bp;HV2区上游引物：5′CGACATCTGGTTCCTACTTC3′，下游引物：5′GAAATCTGGTTAGGCTGGTG3′，扩增片段长度488?bp。

　　50?μL的PCR反应体系中包含1?μL的mtDNA模版，0.1?μmol/L dNTP，1.0?U TaqDNA聚合酶，2.0?mmol/L MgCl2，10×PCR缓冲液5?μL，引物0.2?μmol/L。循环参数：95?℃ 5?min，随后35个循环为：94?℃ 45?s，56?℃ 45?s,72?℃ 45?s,后72?℃延伸7?min。反应结束后，从50?μL反应体系中取5?μL在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶(EB)染色，紫外灯下观察电泳图像并确认所测片段是否成功扩增。

　　1.4 DNA序列测定 证实PCR产物成功扩增后，将剩余的PCR产物纯化后进行测序。将所测线粒体DNA Dloop区的HV1区和HV2区基因序列与剑桥标准序列(revised Cambridge reference sequence，rCRS)进行对比。在骨髓标本中与剑桥序列不一致的位点再与同一患者的口腔上皮正常组织的序列比较，若此位点的变化在口腔上皮组织中未出现，则定义为突变;若在骨髓标本和口腔上皮中均出现，则定义为多态，在数据库(MITOMAP、mtDB和GenBank)没有记录的认为是新的多态位点。计算多态性出现频率，计算公式为：多态性出现频率(%)=多态性个数/所测碱基总数×。

　　2 结 果

　　2.1 琼脂糖凝胶电泳结果 见图1，图2。由图1可见，1～3号标本在470?bp处出现特异条带，证实成功扩增出HV1片段。由图2可见，1～4号标本在490?bp处出现特异条带，证实成功扩增出HV2片段。所有标本均经琼脂糖凝胶电泳证实成功扩增出目的片段。

　　2.2 mtDNA测序结果分析 见表1，图3，图4。在42例MDS患者骨髓标本中共发现多态性改变199个，其中在HV1区(360?bp)131个，单个标本中少发现1个，多发现7个，多态性发生频率为0.87%;HV2 区(316?bp)共68个，单个标本少0个，多5个，多态性发生频率为0.51%。未发现新的多态位点。由表1可见，有6例患者检测到突变，突变位点共19个，计算突变率为14.29%。突变类型为碱基置换突变和微卫星不稳定，未发现碱基缺失。其中5个微卫星不稳定(HV1区4个，HV2 区1个)，这中间有4个是polyC片段中C核苷数目的增加。其余14个突变位点均为A、G或者C、T之间的碱基置换(HV1区6个，HV2区8个)。

　　3 讨 论

　　线粒体DNA由于缺乏组蛋白的保护，裸露于氧化磷酸化的环境中，而且在复制过程中缺乏必要的修复机制，故易受致癌物、氧自由基等的损伤，使其突变率是核DNA的10倍以上[3]。与核DNA相比，mtDNA的基因具有很大的简约性和经济性，其中D环区(Dloop区)是mtDNA的非编码区。Dloop区占全部mtDNA的6%左右，位置在16?028～577?bp，富含AT碱基。mtDNA重链和轻链的转录启动子以及重链的复制起始位点均位于此区域内，因此，如果突变点位于mtDNA基因编码区，将影响各相关酶复合体的功能;如果突变点位于tRNA基因区，则将影响线粒体13个多肽的翻译。如果突变发生在DLoop区，那么情况将严重得多，它将引起整个线粒体功能的紊乱，直接影响线粒体的功能。Dloop区的突变具有积累效应，有随年龄增长而增加的趋势，其中两个高变区(HV1，HV2)由于高度多态性和易发生突变，是近年来研究的热点区域。在对很多实体恶性肿瘤如胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等的研究中均发现存在着一定频率的mtDNA突变，突变率介于4%～90%[47]。而在对血液系统恶性肿瘤的研究中，Grist等[8]发现急性白血病患者Dloop区的突变率为36%，慢性白血病患者为58%，与实体恶性肿瘤的平均突变率相一致。国外虽有文献报道在MDS患者中发现mtDNA Dloop区的突变[910]，但意见不一，研究结果很不一致。由于研究背景和结论差异较大，Dloop区在MDS患者中的突变情况仍存在争论。

　　本实验利用PCR产物直接测序法检测42例MDS患者的mtDNA Dloop区两个高变区基因序列，考虑到mtDNA具有高度的多态性，把骨髓测序结果与剑桥序列对比后，出现变化的位点再与患者本人的口腔上皮组织正常细胞对比，只在骨髓中出现的序列变化才认为是突变。发现在6例患者中有突变，共19个突变位点，其中有5个微卫星不稳定，其余均为C、T，或者A、G之间的碱基置换突变，突变率为14.29%。这6例检测到突变的患者包括3个RA患者，2个RAEB2患者，1个RCMD患者。在RARS和RAEB1亚型中未发现突变点，但因为样本量较小，加之受到病例选择的局限，尚不能排除这两种亚型存在突变的可能性。此外，由于Dloop区不编码蛋白，在进化过程中选择压力相对较小，因而较其他区域具有更高的多态性。本研究中，42例MDS患者mtDNA Dloop区两个高变区共发现了199个多态性变化，这两个区域的多态性出现频率分别为0.87%和0.51%，而人类基因组平均多态性频率约为0.1%，可见MDS患者这两个区域具有高度的多态性。但在本研究中未发现尚未记载的新的多态位点。

　　目前，MDS的发病机制尚不清楚，许多环境因素(苯、电离辐射、超氧毒性等)可能涉及到MDS的发病，而线粒体DNA尤易受到这些因素的损伤。线粒体DNA突变在MDS发病中的作用可能与细胞凋亡有关。已有证据表明，在MDS中骨髓造血细胞凋亡过度是引起无效造血的主要原因。诱导凋亡的信号多数引起线粒体功能的改变，使线粒体内膜通透性增加，膜电位破坏，促使细胞色素C的释放，从而触发caspase级联反应，引起凋亡。由于mtDNA重链和轻链的转录启动子以及重链的复制起始位点均位于Dloop区，因此Dloop区的突变将会影响到mtDNA的复制和转录，直接影响线粒体编码区的功能，引起整个线粒体功能的紊乱，使线粒体对氧化损伤等多种损伤因素更为敏感或者直接造成细胞凋亡的改变。因此，mtDNA Dloop区突变引起的线粒体功能缺陷可能是MDS中细胞凋亡过度的内在原因。此外，研究发现线粒体DNA Dloop区突变与编码区的突变有关[1112]，而某些编码区的突变能引起蛋白质合成改变。因此，可以推测mtDNA Dloop区突变可能导致线粒体呼吸链酶复合体的编码基因异常，造成高水平活性氧的释放，而活性氧又可导致新的突变发生，从而形成恶性循环,并终引发恶性变。

　　线粒体DNA的突变随着年龄的增长具有累积效应，而个体发生恶性肿瘤的可能性随着年龄的增长而提高，这提示线粒体DNA突变的累积与恶性肿瘤发生的可能性是一致的。本研究中16、19和34号患者分别存在多达4个突变位点，推测可能是线粒体DNA损伤的累积效应所致。

　　此外，研究中尚发现5个微卫星不稳定的情况，其中有4个是polyC片段中C核苷数目的增加(见表1)。Maeck等[13]报道在26例MDS患者中发现2例这样的改变，认为这种改变与患者线粒体基因组不稳定有关。与核基因相同，线粒体基因组也存在不稳定，由于活性氧的破坏、滑链错配和不平衡交换等原因造成线粒体基因组的不稳定，其形式以Dloop区的(CA)n和poly C不稳定为常见。多项研究表明，某些癌前病变或肿瘤细胞中均发现线粒体DNA微卫星不稳定，肿瘤细胞与正常细胞间存在明显差异。当mtDNA在多种损伤因素下突变频率增加，mtDNA微卫星不稳定性也随之增加，进而使线粒体发生功能异常，引发肿瘤或其他疾病。

　　关于mtDNA突变在肿瘤发生发展中的具体作用，目前尚无定论，但已证实各种致癌物质能够作用于mtDNA并引起其发生与肿瘤相关的遗传结构的改变。因此，mtDNA突变在肿瘤细胞中的生物学意义应该得到重视。MDS为血液系统的恶性疾病，mtDNA在疾病发生发展中的变化值得探讨。本研究发现MDS患者在Dloop区两个高变区存在突变，线粒体DNA Dloop区在多种损伤因子或致癌物质的作用下发生突变，突变累积增加了肿瘤发生的危险性。我们推测mtDNA异常可能是MDS患者突变负荷增加的一个反映，而且与患者核基因组不稳定性、细胞遗传学异常和向白血病转化的发生相关联。mtDNA突变可能在MDS的发生发展过程中起重要作用。如果mtDNA突变与MDS疾病的发生及生物学特性的关系能得到证实，将为其病因学研究开拓一个新的领域。