沙利度胺对人外周血单个核细胞免疫正调控作用

　   作者：杨云　张王刚　,陈银霞　,曹星梅　　作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院，西安 710004

　　【摘要】本研究观察沙利度胺对外周血单个核细胞(PBMNC)增殖、淋巴细胞亚群、细胞因子分泌及其杀伤活性的影响，探讨沙利度胺治疗MM的免疫调节机理。用MTT法检测PBMNC的增殖及杀伤活性，用流式细胞术检测淋巴细胞亚群的变化，用ELISA方法检测培养上清中细胞因子的浓度。结果表明：与阴性对照组相比，沙利度胺可明显刺激正常人PBMNC中CD8+T、NK细胞的增殖，显著增加IL-6的分泌，减少IFN-γ 的分泌，不影响IL-2 、IL-10的分泌;在同一效靶比时，5 μg/ml的沙利度胺可明显增强PBMNC的杀伤活性(P< 0.01)，效靶比为40∶1时沙利度胺组杀伤活性强。结论：沙利度胺主要刺激PHA活化后的正常人PBMNC中CD8+T、NK细胞的增殖及IL-6的分泌来增强PBMNC的杀伤活性，通过增强细胞免疫功能发挥抗骨髓瘤作用。

　　【关键词】 沙利度胺,多发性骨髓瘤,免疫调节,抗肿瘤免疫

　　AbstractThis study was purposed to investigate the effects of thalidomide on proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs), levels of lymphocyte subsets, secretion of cytokines and its killing activity, and to elucidate the immnoregulation mechanisuns in treatment of multiple myeloma with thalidomide. The method of MTT was used to detect the effects of thalidomide on the proliferations and the cytotoxic activity of PBMNC; the flow cytometer was used to analyze the lymphocyte subsets; the ELISA was used to measure the concentrations of cytokines in culture supernatants. The results showed that thalidomide enhanced the proliferations of the CD8+T, NK cells in PHA-stimulated PBMNC from healthy volunteers, increased the secretion of IL-6 significantly, and decreased the secretion of IFN- γ, and the secretions of IL-2 and IL-10 were not affected. Compared with control group, at the same ratio of effectors to targets the thalidomide (5 μg/ml) could enhance the cytotoxic activity of PBMNC (P< 0.01), the cytotoxic activity was maximal when the ratio of effectors to targets was 40∶1. It is concluded that thalidomide preferentially enhances the proliferations of CD8+T, NK cells in PHA-stimulated PBMNC from healthy volunteers, and enhances the cytotoxic activity of PBMNC by increasing the secretion of IL-6 significantly, in short, thalidomide can exert anti-myeloma effects by increasing cellular immune function.

　　Key wordsThalidomide; Multiple myeloma; Immunoregulation; Anti-tumor immunity

　　多发性骨髓瘤(MM)的治疗目前仍是世界性难题，临床上缺乏理想的治疗方法。自从Singhal等[1]1999年将沙利度胺用于MM的治疗取得显著疗效以来，已进行的多个临床试验结果显示，沙利度胺对MM有肯定的作用，约32%-64%的患者可获得疗效，而且副作用小、使用方便、费用小，是临床上安全、有效、经济的治疗MM的理想药物。但是，沙利度胺治疗MM的机制目前还不清楚，人们的沙利度胺的抗肿瘤机制即血管生成抑制作用与临床的疗效间缺乏相关性，在沙利度胺治疗有效者未观察到骨髓微血管密度下降。越来越多的证据表明，免疫调节作用可能是沙利度胺治疗多发性骨髓瘤的主要机理。目前，有关沙利度胺治疗MM免疫调节机理的报道甚少，我们研究不同浓度的沙利度胺对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)增殖、淋巴细胞亚群、细胞因子分泌及其杀伤活性的影响，以期进一步阐明沙利度胺治疗MM的机理，为其临床应用提供理论依据。

　　材料和方法

　　临床资料

　　正常人10例来源于健康志愿者，男6例，女4例，年龄24-56岁，中位数年龄38岁，经体格及相关实验室检查确定为健康人。

　　细胞株、试剂及仪器

　　人多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226购于中国医学科学院基础医学研究所，沙利度胺(商品名：反应停) 购于Sigma公司，RPMI 1640培养液(10.5 g)购于Gibco公司，胎牛血清(100 ml)购于杭州四季青生物科技有限公司，淋巴细胞分离液购于上海华精生物科技有限公司，MTT粉购于华美生物工程公司，PHA购于上海伊华医学科技有限公司，淋巴细胞亚群检测试剂盒购于美国Becton Dickinson公司，人IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10 ELISA试剂盒购于北京莱博生物科技有限公司。

　　沙利度胺的配制

　　称取20 mg沙利度胺溶于1 ml DMSO中，配成沙利度胺贮备液(20 mg/ml)，临用前用培养液稀释至所需浓度。

　　沙利度胺对PBMNC增殖影响的MTT检测

　　无菌抽取健康人外周血20 ml，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，小心吸取各管中间白膜层于另一离心管中，加入氯化胺作用8分钟，用含10%胎牛血清的RPMI 1640洗3遍，调整细胞浓度为3×105/ml，除调零孔外，每孔需加入PHA 1 μl(1 mg/ml)，使各孔PHA终浓度为5 μg/ml，将细胞加入96孔圆底培养板中，每孔加入3×104个细胞。设5个沙利度胺浓度组： 0.1、1.25、 5、20和100 μg/ml，每种浓度设3个复孔，同时设阴性对照组、调零孔组及DMSO对照组。沙利度胺稀释为 250 μg/ml加入各不同浓度组，每孔终体积为200 μl， 37℃、5% CO2下培养72小时后，按常规操作步骤进行。然后上酶联免疫检测仪，在490 nm波长下测各孔吸光度OD值。

　　沙利度胺对淋巴细胞亚群影响的流式细胞术检测

　　外周血单个核细胞的分离方法同上，调整细胞浓度为1×106/ml，每瓶加入2 ml。设6个沙利度胺浓度组： 0、0.1、1.25、5、20和100 μg/ml, 并设二甲亚砜组为对照，同时每瓶各加PHA 2 μl(12.5 mg/ml)，每瓶终体积为5 ml，各瓶 PHA终浓度为5 μg/ml。细胞在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素及链霉素的RPMI 1640培养液中于37℃、5% CO2下培养72小时，然后收获各培养瓶中的细胞，用0.01 mol/L PBS洗1遍，调整细胞浓度为5×106/ml，检测按FACS检测淋巴细胞亚群试剂盒操作说明进行。

　　沙利度胺对PBMNC细胞因子分泌影响的ELISA检测

　　用ELISA方法检测培养上清液中IL-2、 IFN-γ、IL-6、IL-10的水平，操作按试剂盒说明书进行。

　　沙利度胺对PBMNC杀伤活性影响的MTT检测

　　以外周血单个核细胞为效应细胞，调整细胞浓度分别为106/ml、2×106/ml及4×106/ml;以对数生长期的RPMI 8226细胞为靶细胞，调整细胞浓度为105/ml;共设2组，分别为阴性对照组及沙利度胺组(5 μg/ml)，同时设立效应细胞对照、靶细胞对照、加沙利度胺的靶细胞对照(5 μg/ml)和RPMI 1640调零孔。除靶细胞对照和调零孔外，其余各孔加入PHA 1 μl(1 mg/ml)，在96孔培养板中每孔加入效应细胞、靶细胞各50 μl，每孔设3个复孔，终体积为200 μl，共设3个效靶比，分别为10∶1、20∶1、40∶1，每组10个样本。37℃、5% CO2下培养72小时，操作按常规步骤进行。按下列公式计算杀伤百分比。

　　杀伤百分比=[1-(ODE+T-ODE)÷ ODT]×

　　式中，ODE+T为效应细胞+靶细胞OD值; ODE为效应细胞OD值; ODT为靶细胞OD值。

　　统计学分析

　　以SPSS 10.0统计软件进行统计分析，组间比较采用成组设计的两样本均数比较的t检验。以P<0.05为检验水准。

　　结果

　　沙利度胺对PBMNC增殖的影响

　　研究结果列于表1和图1。由表1和图1可见，与阴性对照组相比，随着浓度的增加，沙利度胺各浓度组OD值明显增加(P<0.01)，其中5 μg/ml浓度组OD值高(0.216±0.007)。随着浓度的继续增加，OD值渐下降，但仍明显高于阴性对照组。二甲亚砜对照组OD值与阴性对照组相比无显著性差异(P>0.05)。Table 1. Proliferation ability of PBMNC treated by diffe-rent concentrations of thalidomide (略)

　　沙利度胺对淋巴细胞亚群的影响

　　研究结果列于表2和图2、3。由表2及图2、3可见，与阴性对照组相比，不同浓度的沙利度胺可刺激CD4+T细胞的增殖，但经统计学检验无显著性差异(P>0.05)，随着沙利度胺浓度的增加，CD8+T细胞的比例较阴性对照组有明显的提高(P<0.05或0.01)，但各浓度组B细胞比例与阴性对照组相比无显著差异(P>0.05);随着沙利度胺浓度的增加，除0.1 μg/ml组外，NK细胞比例渐增高，与阴性对照组相比，差异有显著性(P<0.01)，在5 μg/ml时，达到高，为9.67±1.53%。二甲亚砜对照组各亚群比例与阴性对照组相比无显著性差异(P>0.05)。Table 3. Concentration of cytokines in culture supernatants of PBMNC treated by different concentrations of thalidomide

　　(略)Table 2. Lymphocyte subsets in PBMNC treated by different concentrations of thalidomide (略)

　　沙利度胺对PBMNC细胞因子分泌的影响

　　研究结果列于表3和图4。由表3和图4可见，不同浓度的沙利度胺对IL-2的分泌无明显影响(P>0.05)，与阴性对照组相比，随着浓度的增加，IFN-γ 的分泌渐减少, 除1.25 μg/ml组外，各浓度组与阴性对照组相比，差异有显著性(P<0.01);沙利度胺明显刺激IL-6的分泌(P<0.01)， 5 μg/ml时达高，为阴性对照组的7.19倍;各浓度组的沙利度胺对IL-10的分泌无明显影响(P>0.05)。

　　沙利度胺对PBMNC杀伤活性的影响

　　由表4可见，与阴性对照组相比，在同一效靶比时，5 μg/ml的沙利度胺可明显增强PBMNC的杀伤活性(P<0.01);同一组内比较的结果为：效靶比为40∶1时杀伤活性强，沙利度胺组效靶比为40∶1时的杀伤活性较效靶比为20∶1及10∶1时明显提高(P<0.01)，而阴性对照组效靶比为40∶1时的杀伤活性明显高于效靶比为10∶1时(P<0.01)，与效靶比为20∶1时的杀伤活性比无显著性差异(P>0.05)。Table 4. Killing activity of PBMNC treated by thalidomide (略)

　　讨论

　　研究表明，MM患者骨髓的血管增生与对沙利度胺治疗的反应无相关性，治疗有效者未见骨髓微血管密度明显变化[1]，经沙利度胺治疗后促血管生成因子VEGF、BFGF等的水平无明显下降[2,3]，并且体外实验表明，沙利度胺抑制骨髓瘤细胞的增殖，诱导瘤细胞的凋亡作用仅在高浓度下才起作用[4]，而这一浓度在患者血浆中难以达到。沙利度胺仅对少数骨髓瘤细胞系有诱导凋亡作用，对源于患者的骨髓瘤细胞无诱导凋亡作用[5]。这些结果表明，抗血管增生及诱导瘤细胞凋亡不是沙利度胺发挥抗骨髓瘤作用的主要机制。已有研究表明，体外沙利度胺可通过增强TCR的作用增加IL-2介导的T细胞增殖和IFN-γ 的产生[6,7]，新的沙利度胺类似物被称为免疫反应调节药物，其抑制PBMNC产生TNF-α的作用是沙利度胺的5 000倍，这些类似物是强有力的T细胞增殖和IL-2、IFN-γ 产生诱导剂，并且有抑制IL-1 及IL-6分泌的作用[7]。因此许多学者认为，沙利度胺的免疫调节作用可能是其抗骨髓瘤作用的主要机制。目前认为，沙利度胺的免疫调节作用主要是抑制TNF-α的生成及调节细胞因子的产生。我们对健康人外周血单个核细胞的体外研究表明，一定浓度的沙利度胺可明显增强PHA刺激后的PBMNC增殖，CD8+T细胞及NK细胞的比例较阴性对照组明显提高，经沙利度胺刺激后PBMNC的杀伤活性明显高于对照组，5 μg/ml(效靶比为40∶1)时杀伤活性强。这些结果表明，沙利度胺主要增强PHA刺激后的PBMNC中CD8+T细胞及NK细胞的增殖，通过增强CD8+T细胞及NK细胞的杀伤活性来发挥抗骨髓瘤作用。我们的研究结果表明，经沙利度胺作用后PBMNC分泌IL-6明显增加，IL-6的分泌高为对照组的7.19倍，同时IFN-γ 的分泌明显减少，而 IL-2、IL-10的分泌无明显变化。这一结果具有重要的意义。近期的研究证实了传统T细胞的激活需要特定的细胞因子环境，尤其不可缺少的是DC产生的IL-6, 以逃避CD4+CD25+Treg的抑制作用[8,9]。我们的实验发现了PBMNC分泌IL-6明显增加，同时PBMNC杀伤活性增强，因此认为，沙利度胺可能通过刺激正常人PBMNC分泌IL-6，通过解除CD4+CD25+Treg的免疫抑制作用活化CTL来发挥抗肿瘤作用，同时IL-6可通过拮抗骨髓瘤细胞分泌的TGF-β对NK细胞的抑制作用[10]来增强NK细胞的杀伤活性。沙利度胺刺激PBMNC增殖的机理目前还不是很清楚，有学者认为是因为刺激T细胞产生内源性的IL-2，促进PBMNC或T细胞的增殖[6,11];但有些实验并未观察到IL-2的增加。近，LeBlance等[12]认为，沙利度胺可能是通过作为一种共刺激因子刺激T细胞的增殖，其可触发T细胞上CD28的酪氨酸磷酸化，随之活化CD28信号通路的NF-κB而发挥作用。关于沙利度胺调节PBMNC细胞因子分泌的机理，Rowland等[13]认为,可能是通过调节mRNA的表达实现的。总之，通过沙利度胺对正常人PBMNC作用的体外研究表明，沙利度胺可刺激PHA活化后的CD8+T细胞、NK细胞的增殖及IL-6的分泌来增强PBMNC杀伤活性。这些结果表明，增强细胞免疫功能可能是沙利度胺治疗多发性骨髓瘤有效的机制之一。