尿液甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定在2型糖尿病和高血压患者中的诊断价值

    作者：杨恺,热依汗•谢以提,王学涵　　作者单位：新疆医科大学附属医院检验中心, 第五附属医院检验中心, 新疆乌鲁木齐

　　【关键词】 2型糖尿病

　　2型糖尿病(2DM)和原发性高血压(EH)常有共同的环境遗传因素和发病机制,二者可同时或相继发生。肾脏是2DM和EH主要累及的靶器官之一[1]。几乎所有DM患者随病情的发展，病程的延长，终将出现不同程度的微血管病变，继而发生肾脏的损害。当常规出现尿蛋白时，肾脏病变往往不可逆转，终导致肾功能衰竭，这也是导致DM患者死亡的主要原因[2]。因此，早期发现DM患者肾脏受损，及时采取合适的治疗措施，阻止或延缓DM的并发症，具有重要的临床价值。1966年 Hopsu_Havuh 等在鼠的肝、肾中发现一种新的二肽氨基肽酶。此后，国外学者提纯了甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA)，并且建立了测定方法。国内自80年代陆续开展了血清GPDA测定方法及临床应用研究，并对其临床应用价值进行了初步探讨[3]。我科对225例正常人和55例已确诊的2型糖尿病及36例高血压患者进行了尿液甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA)测定，并与正常健康对照组比较，以探讨测定GPDA对2型糖尿病和高血压患者肾脏早期损害的诊断价值。

　　1资料与方法

　　1.1研究对象糖尿病和高血压患者疾病组：其中2型糖尿病患者55例，发生肾损害组23例，未发生肾损害组32例，平均年龄54岁。高血压患者36例，发生肾损害组15例，未发生肾损害组21例，平均年龄56岁。正常对照组：体检正常者225例，男性116例，女性109例，平均年龄49岁。

　　1.2标本采集随机留取的新鲜尿液10 ml，3 000r/min离心沉淀10 min，取上清液于4 h内完成测试。

　　1.3方法

　　1.3.1检测原理尿液中GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者可引起吸光度的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比。

　　1.3.2测定方法采用连续监测法以甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺为底物检测尿液GPDA,试剂盒为北京利德曼公司产品;尿液肌酐(Cr)采用Jaffe速率法测定，试剂盒由BECKMAN公司提供,仪器为美国BECKMAN公司全自动生化分析仪LX20。在BECKMAN全自动生化分析仪上，主波长410 nm ，副波长600 nm，样品10 μl，根据公式计算尿酶活性:

　　尿GPDA酶活性[U/(g•Cr)=尿GPDA(U/L)/尿Cr(g/L)]

　　尿Cr(g/L)=Cr (μmol/L)×0.000 113

　　1.4判定指标糖尿病和高血压合并肾损害分为3个阶段：阶段肾小球基本正常,肾内压增加，此时可出现尿微量蛋白升高，微蛋白尿作为判断肾脏早期损伤的“金指标”;第二阶段肾小管高压性损伤随后出现肾小球早期损伤,可出现血中β2微球蛋白轻度升高;第三阶段肾小球硬化,肾小管萎缩(主要为肾小球损伤的证据)。

　　1.5统计学处理同年龄组不同性别间及不同疾病GPDA比较采用t检验，不同年龄组间显著性检验采用F检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1线性范围将一份GPDA高值(350 U/L)尿液标本，用生理盐水作倍比稀释后，结果在350 U/L以下线性良好。

　　2.2精密度结果取高、低值尿液标本各一份，分别作批内和批间重复性测定。批内重复测定20次，作为批内重复观察指标，其变异系数为0.61%～1.27%;批间测定时，将标本4℃冷藏，每天重复测定3次，连测6 d，作为批间重复观察指标，其变异系数为0.70%～1.33%。

　　2.3尿GPDA稳定性将尿液标本分别置20℃室温和4℃冰箱存放,每天检测。结果4℃保存7 d，GPDA活性无变化，20℃室温存放(加防腐剂)7 d，GPDA活性下降11.2%。

　　2.4干扰试验在已测量GPDA活性的尿液中分别加入不同浓度的胆红素、血红蛋白、维生素C、葡萄糖及二甲双胍、格列苯脲做干扰试验。结果显示胆红素171 μmol/L、维生素C 6 g/L、葡萄糖30 g/L、二甲双胍3 g/L、格列苯脲20 mg/L时对GPDA测定无影响：血红蛋白浓度<500 mg/L时对GPDA测定无影响，当其浓度>500 mg/L时，可使GPDA测定结果偏低，1 000 mg/L时可使GPDA下降约17%。

　　2.5正常参考值225名不同年龄组体检正常者尿液GPDA活性，经D检验呈正态分布，男女性别间GPDA活性差异无统计学意义(P> 0.05)，不同年龄组间GPDA差异亦无统计学意义(P>0.05)(表1)。

　　2.6糖尿病、高血压病患者及正常对照组尿GPDA测定结果高血压肾损害组、糖尿病肾损害组与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。而正常对照组与高血压、糖尿病未发生肾损害组尿GPDA比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

　　表1225例正常人GPDA参考值 (略)

　　表2糖尿病、高血压病患者尿GPDA测定结果与正常人比较(略)

　　注：与正常对照组比较, *P<0.01

　　3讨论

　　血清中GPDA是分子量为220 000的大分子量蛋白，不易通过肾小球基底膜。因此，尿中GPDA大多来源于肾脏，由于肾脏特别是肾小管中含有较丰富的GPDA，当肾脏受损时，GPDA便排入尿液，使尿中GPDA活性升高[4]。GPDA的测定目前多数以新人工底物甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺为检测，方法有连续监测法、非连续的直接比色法和间接比色法。我们通过对各种检测条件及干扰因素下的血清及尿液GPDA的测定试验观察，用连续监测法测定尿液中GPDA具有简便、快速、重复性好、线性范围宽、敏感度高、结果准确等优点，本法所用底物稳定易溶。本研究显示，225名体检正常者尿液GPDA测定值为(12.9±4.1)U/(g•Cr)，呈正态分布，且参考值范围为4.9～20.9 U/(g•Cr)，可为临床应用提供一定的参考数据。本研究还显示发生早期肾损害者尿GPDA的活性显著高于未发生肾损害组及正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。由此可见，尿液GPDA是诊断高血压及糖尿病患者早期肾脏损害的敏感指标,特别是肾小管早期损伤,对于高血压、糖尿病肾病的早期诊断、肾功能损害程度判断具有一定的价值。因此，通过测定尿GPDA可判断早期肾脏损害的发生。