Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

　　作者：陈丽娟,李建勇,钱思轩,朱广荣　　作者单位：南京医科大学附属医院、江苏省人民医院血液科，南京
　　多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤，多发生于老年人。随着社会人口的老龄化，其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合治疗，尽管近年来加用反应停抑制血管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗，但其仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。由此可见，开发新的治疗方法有重要的临床价值。蛋白酶体抑制剂近年来作为MM新的治疗制剂用于临床试验，本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的凋亡作用进行探讨。
　　材料和方法
　　细胞培养

　　U266细胞置于含10%的热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液(Gibco公司产品) 中，于37℃、5% CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中，细胞以(2-5)×105 细胞/毫升的密度接种培养，并与不同浓度velcade一起进行孵育，对照加DMSO。细胞活率由台盼蓝拒染法检测，根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。形态学观察，细胞用cytospin (Shandon，Runcorn，UK)收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。每次试验重复3次。生长抑制率及细胞活率按如下公式计算：
　　生长抑制率 =[(对照组细胞数-处理组细胞数)/对照组细胞数]×　存活率=[活细胞数/(活细胞数+死细胞数)]×

　　Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基(ROS)的流式细胞仪分析

　　Annexin-V 分析

　　使用FITC标记的Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡，根据 Becton Dickinson Biosciences 公司提供的说明书进行操作。简单地说，取(1-2)×105 细胞，经PBS 漂洗后加100 μl 结合缓冲液，重悬细胞，加5 μl AnnexinV-FITC，10μl PI 避光孵育15 分钟后加400 μl 结合缓冲液，用流式细胞仪检测。
　　线粒体跨膜电位(Δψm)检测
　　取5×105细胞，用PBS清洗1次，加入10 μg/ml Rh123(Sigma公司产品)37℃孵育30分钟，用PBS漂洗1次，加入终浓度10 μg/ml PI 4℃暗处放置30分钟，用流式细胞仪检测。
　　活性氧测定 细胞内活性氧测定方法参照文献[1]方法进行，DCFHDA (Sigma公司产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF 荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF 的激发波长为485 nm，吸收波长为530 nm。将药物处理的细胞(1×105)经过PBS洗涤，重悬于1 ml含有10 μmol/L DCFHDA的PBS中，以未加染料的样品作为对照，37℃孵育20分钟，以PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测5 000个活细胞的荧光强度。
　　velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266 bcl-2 mRNA表达的半定量RT-PCR检测
　　细胞总RNA抽提 收集3×106细胞，用TRIzoL试剂(Gibco BRL产品)按说明书抽提细胞总RNA。
　　cDNA 合成及PCR 扩增 方法参见文献[ 2 ]，PCR引物：GAPDH：有义链5′-GAAGGTGAAGGT CGGAGTCA-3′;反义链5′-GAAGATGGTGATGG GATTTC-3′。bcl-2: 有义链5 ′-ACTTGTGGCCCA GATAGG-3′，反义链为5′-CGACTTCGCCGAGAT GTC-3′。PCR 产物用6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳分析照相，在双波长色谱扫描仪上扫描电泳带。GAPDH片段长度216 bp，bcl-2片段389 bp。
　　结 果
　　velcade对U266细胞增殖抑制和杀伤作用
　　研究结果表明，velcade可以抑制U266细胞的生长，同时伴有细胞活率的降低。U266细胞经2、10、50和100 nmol/L浓度velcade 24小时处理后生长抑制率的3次均值分别为18.7%、45.45%、59.86%和68.9%，48小时时分别为34.45%、61.46%、73.75%和82.04%;在0、2、10、50和100 nmol/L浓度时24小时活率分别为97.31%、91.38%、79.91%、61.48%和42.62%，48小时时分别为96.57%、76.60%、58.41%、30.40%和14.05%。根据活率48小时时下降70%-80%选择药物浓度，因此选择velcade 50 nmol/L作为药物处理浓度(图1)。
　　velcade对U266细胞凋亡作用

　　50 nmol/L velcade处理的U266细胞呈现出细胞形态学改变，表现为染色体凝聚、细胞核破裂而细胞膜保持完整及出现多个凋亡小体等(图2A)。24小时Annexin V-FITC/PI 双标结果显示，凋亡细胞比例重复3次的均值为61.3%，明显高于未用velcade处理对照组的3.56%(图2B)。线粒体跨膜电位(△ψM)检测显示△ψM降低，Rh123阳性细胞比率重复3次的均值为56.3%，对照为95.02%(图2C)。
　　活性氧检测
　　我们采用DCFHDA检测velcade处理的U266细胞活性氧及平均荧光强度。结果发现，在12小时时活性氧明显增高，平均荧光强度显著增高，由对照的1.95增强到10.8，流式细胞仪直方图右移(图3)。
　　bcl-2检测
　　采用RT-PCR检测内源性细胞凋亡通路主要的基因bcl-2。结果显示，U266细胞经50 nmol/L velcade处理后，随着作用时间的延长，其表达逐渐降低(图4)。
　　讨 论
　　泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway，UP通路)是由泛素化系统和蛋白酶体组成，在调节细胞周期和肿瘤生长中有着重要的作用，该通路参与细胞内绝大多数的蛋白降解，如许多重要的涉及细胞信号转导、转录调控和细胞周期的调节蛋白。蛋白酶体存在于所有的真核细胞中，蛋白酶体抑制剂可以通过干涉这些重要蛋白的降解，触发肿瘤细胞周期阻滞，诱导肿瘤细胞凋亡而使肿瘤进展延缓或静止[3-7]。
　　Velcade 是一种硼酸二肽化合物，是高选择性、可逆性的26S蛋白酶体抑制剂，首先在美国国家肿瘤协会的一组60种肿瘤细胞系中表现出抗肿瘤作用。velcade对MM细胞的作用表现在诱导细胞凋亡、抑制生长、抑制细胞黏附和骨髓血管生成等多个方面。本研究显示，其对U266细胞具有增殖抑制作用，并随着时间的延长和剂量的增加呈现增殖抑制加强，活率降低趋势。
　　诱导细胞凋亡有3种信号通路：FAS信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路，目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用。细胞凋亡过程中，细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏，发生磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)由内层向外层的翻转，暴露在外面的磷脂酰丝氨酸可被周围的吞噬细胞识别、吞噬，从而使凋亡细胞得以被清除。
　　Annexin V 为一种磷脂结合蛋白，可特异性地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，所以经常被用于检测细胞凋亡[8]。Rh123 是一种亲脂性阳离子，可发射绿色荧光，它可被线粒体吸收，并且其吸收量与线粒体△ψm成正比[9]。正常的活细胞因为线粒体△ψm高，所以其摄入的Rh123 也高，因此细胞会发出绿色荧光。而细胞发生凋亡时线粒体△ψm会降低，细胞表现为Rh123 低染。本研究结果显示，Velcade处理U266细胞24小时时凋亡细胞明显增高，△ψm明显降低，这说明细胞大部分是通过诱导细胞凋亡而死亡的，Velcade还可通过线粒体信号通路，即内源性凋亡途径诱导U266细胞凋亡。
　　ROS 是细胞有氧呼吸过程中产生的一些小分子物质，主要包括O-2 、OH-及其活性衍生物如H2O2 、HOCl 、O2等。这些物质具有较高的反应活性，易与细胞内的大分子物质反应，导致细胞结构的广泛损伤，如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸等的氧化损伤等。近年的研究认为，活性氧是细胞凋亡的信号之一，ROS的产生可直接或间接改变线粒体膜电位，促进Cyt C从线粒体内释放，启动线粒体信号通路，诱导细胞凋亡[10]。线粒体是ROS产生的主要场所，内质网(ER)中同样会有ROS的生成。Fribley 等报道[11]蛋白酶体抑制剂velcade通过同时诱导ER应激(stress)和ROS生成引起人头颈癌细胞凋亡，ROS的抑制剂Tiron能够显著抑制凋亡，caspase-9和caspase-3的活化，并且能够阻碍ER应激相关蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表达。这些结果提示，ROS在ER 应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。用DCFHDA 作为荧光探针测定细胞内ROS 水平时，发现velcade在24小时时能明显增高U266细胞内活性氧水平，这说明velcade可改变多发性骨髓瘤细胞内氧化还原状态，导致线粒体和内质网产生ROS增多，从而诱导U266细胞凋亡。由此我们推测，不仅线粒体途径参与了velcade诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡，而且ER应激途径也可能通过ROS的产生而发挥诱导凋亡作用。
　　bcl-2基因是抗细胞凋亡的关键基因，其表达的增高与多种肿瘤有着密切关系，并且可导致肿瘤细胞抵抗糖皮质激素、柔红霉素、阿糖胞苷及VP16等化疗药物诱导的凋亡，使肿瘤细胞对各种化疗药物耐受，导致缓解率低[12]。bcl-2表达降低在内源性细胞凋亡即线粒体信号通路中起关键作用，很多化疗药物可通过抑制bcl-2基因表达从而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究通过半定量RT-PCR的方法检测了bcl-2 mRNA的表达，结果显示其表达水平降低，并随着velcade药物作用时间的延长而表达量逐渐减少，这一结果从分子水平进一步证实了velcade的诱导细胞凋亡作用及其作用机制主要是通过线粒体信号通路。