PPARγ基因多态性与2型糖尿病脂代谢的关系

　　作者：李蕴博,杜丹华,郭晖,高鹏　　作者单位：吉林大学医院神经外科，吉林 长春

　　【摘要】目的 探讨PPARγ基因多态性与2型糖尿病患者脂代谢异常的关系。方法 本研究共纳入191例2型糖尿病患者。以rs1875796为遗传标记，应用多聚酶链限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术检测PPARγ基因rs1875796的基因型。应用氧化酶法测定入组患者血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HLDC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)的水平。结果 2型糖尿病患者PPARγ基因rs1875796的等位基因频率与TC、HDLC和LDLC水平无明显相关。但经性别分层后，女性2型糖尿病患者的TC、LDLC水平与PPARγ基因rs1875796的等位基因频率呈显著性相关(分别为χ2=9.378，P=0.002和χ2=11.187，P=0.000 8)。携带C等位基因个体的TC水平和LDLC水平明显高于携带T等位基因的个体。结论 女性2型糖尿病患者TC、LDLC水平与PPARγ基因ts1875796多态性可能有关。
　　【关键词】 2型糖尿病;PPARγ基因;总胆固醇;低密度脂蛋白胆固醇;单核苷酸多态性
　　胰岛素抵抗是2型糖尿病发病基础之一，而脂肪细胞因子分泌异常是胰岛素抵抗的一个重要机制。研究表明过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ)在脂肪细胞分化、糖、脂代谢和肥胖特异性基因的表达中具有重要作用〔1〕。PPARγ mRNA存在三种剪接变体，即PPARγ1﹑PPARγ2和PPARγ3〔2〕，其中PPARγ2在脂肪组织中有高水平的表达〔3〕。研究发现PPARγ介导的信号传导通路调控脂代谢特别是胆因醇的代谢〔4，5〕。目前已证实高加索人PPARγ基因多态性与2型糖尿病的发病风险相关〔6〕。但PPARγ基因多态性与脂代谢关系的研究却存在很大争议〔7～9〕。本研究以PPARγ基因为候选基因，探讨了PPARγ基因多态性与2型糖尿病患者脂代谢的关系。
　　1 资料与方法
　　1.1 研究对象

　　本院内分泌科20052007年住院并确诊为2型糖尿病的患者191例，男113例，女78例，平均年龄(56.5±11.2)岁。所有入组患者均符合1997年美国糖尿病学会(ADA)的2型糖尿病诊断标准，并且入院前1个月未用过调脂药物。排除严重的其他系统疾病。所有入组患者均签署知情同意书，并采集全血用于DNA提取。
　　1.2 方法

　　1.2.1 血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)浓度的检测 应用氧化酶法测定。
　　1.2.2 PPARγ基因rs1875796基因型的检则
　　选择rs1875796(Hha I site，SNP1)和rs1699337(Hinf I site，SNP2)2个单核苷酸多态性(SNPs)位点，采用限制性酶切片段多态性的方法检测SNPs的基因型。①DNA提取试剂盒(Promega)提取基因组DNA。②PCR反应：应用Primer5.0软件设计引物。SNP1位点上游引物：5′GTGGCTATCTTTGGCTGTTTG3′，下游引物：5′ACCAAGTGTCTGTTGCTCCTG3′;SNP2位点上游引物：5′TTCTTGACCACCGAGGCT3′，下游引物：5′CTCTGCGTAGCTGATTGGAC3′。PCR反应体系为25 μl，其中双蒸水18 μl，10 mmol TrisHCl(pH 8.3)，50 mmol KCl，1.5 mmol MgCl2，4种dNTP各200 μmol，引物各0.4 μmol，Taq DNA 聚合酶(Promega，北京) 1.0 U，基因组DNA 30～50 ng。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环，后72℃延伸10 min。③酶切体系：PCR产物以限制性内切酶(Promega)于37℃水浴4～6 h酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳(90 mV)30 min，在凝胶成像系统(上海培清科技公司)下观察结果。
　　1.3 统计学处理
　　应用拟和优度检验分析2型糖尿病患者基因型频率的分布是否符合HardyWeinberg平衡;UNPHASED遗传学软件〔10〕Qtphase对近似正态分布的计量资料体重指数(BMI)、TC、LDLC和HDLC进行数量性状分析;将不符合正态分布的计量资料转化为计数资料，应用UNPHASED遗传学软件Cocaphase进行分析。
　　2 结 果
　　2.1 SNP1和SNP2位点杂合度分析及SNP1位点HardyWeinberg平衡分析

　　在检测的2个SNPs位点中，只有SNP1在中国汉族人中的多态性较高，可以作为遗传标记进行关联分析。SNP1经PCR扩增及Hha I酶切后，产生3种基因型：野生型TT纯合子，突变型CC纯合子和CT杂合子。基因型分布CC∶CT∶TT为6∶50∶135，等位基因分布C：T为62：320。拟和优度检验表明入组患者SNP1位点的基因型未偏离HW平衡(病例组χ2=0.266，P=0.606;男性χ2=0.207，P=0.649;女性χ2=2.378，P=0.123)，说明选择的样本是随机婚配的群体。
　　2.2 PPARγ基因rs1875796多态性与TC、HDLC、LDLC、BMI的关系
　　2型糖尿病患者PPARγ基因rs1875796的等位基因频率与TC、HDLC、LDLC水平和BMI无明显相关。经性别分层后，女性2型糖尿病患者的TC、LDLC水平与PPARγ基因rs1875796的等位基因频率呈显著性相关(分别为χ2=9.378，P=0.002和χ2=11.187，P=0.000 8)。携带C等位基因个体的TC和LDLC明显高于携带T等位基因的个体。男性2型糖尿病患者PPARγ基因rs1875796的等位基因频率与TC、HDLC、LDLC水平和BMI无明显相关(见表1～表3)。表1 PPARγ基因rs1875796的等位基因频率与2型糖尿病体重指数及血脂水平的关系(略)表2 PPARγ基因rs1875796的等位基因频率与女性2型糖尿病体重指数及血脂水平的关系(略)表3 PPARγ基因rs1875796的等位基因频率与男性2型糖尿病体重指数及血脂水平的关系(略)

　　2.3 SNPs等位基因频率与TG水平的关系
　　由于入组患者的血清TG水平不符合正态分布，因此将其转化为计数资料进行分析。Cocaphase分析表明SNP1的等位基因频率在合并高TG血症和非高TG血症的2型糖尿病患者中无显著差异，经性别分层后仍无显著性差异(P>0.05)。
　　3 讨 论
　　人类PPARγ基因定位于染色体3p25，全长大于200 kb，包括9个外显子。PPAR基因的剪接变体PPARγ2在脂肪组织中有高水平的表达〔3〕，PPARγ介导的信号传导通路调控脂代谢特别是胆固醇的代谢〔4，5〕，因此PPARγ基因与脂代谢特别是胆固醇的代谢密切相关。
　　以往有关PPARγ基因多态性与脂代谢关系的研究多集中于2号外显子区的Pro12Ala错义突变，但所得结论不一〔7～9〕。Pro12Ala在不同种族人群中的突变频率不同，在中国汉族人群中的频率较低，约1%。以往大多数以中国汉族人群为对象的研究未发现该错义突变位点与脂代谢或2型糖尿病的关系〔11，12〕。近研究发现许多与疾病相关的遗传标记位于非编码区或基因功能未知的区域〔13〕，而在进化上古老的常见多态中即使是轻微的有害变异也不会在人群进化中保存下来〔14〕。因此本研究选择了位于4号内含子上的rs1875796位点及5号内含子上的rs1875796位点作为遗传标记。
　　本研究应用数量性状分析方法探讨了PPARγ基因rs1875796多态性与2型糖尿病患者血脂水平的关系。2型糖尿病是多基因遗传病，它的形成是由于多个微效基因变异的共同作用引起的，这些变异在群体中的分布是连续的，在不同个体间只有量的差异，而无质的不同，常称这类性状为数量性状。因此对多基因遗传疾病的某些连续性性状进行数量性状分析更符合疾病发生的本质。
　　本研究发现女性2型糖尿病患者的TC、LDLC水平与PPARγ基因rs1875796的等位基因频率呈显著性相关。携带C等位基因个体的TC水平和LDLC水平明显高于携带T等位基因的个体。已有研究证实雌激素水平增高可上调PPARγ2的表达〔15〕，而PPARγ2的表达下调可引起脂代谢紊乱。本研究入组的女性患者的平均年龄为(56.8±11.5)岁，多为绝经后及围绝经期女性，普遍存在雌激素缺乏。因此推测，由于女性雌激素水平降低，导致PPARγ2的表达下调，进而导致了TC和LDLC水平升高。
　　此外，本研究人群来自于北方汉族人，这一研究结果还需要在不同地域、不同种族的人群中进行大样本的重复来验证。
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