抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究

　　作者：林东军,方志刚,李旭东,刘加军,陆英　　作者单位：中山大学附属第三医院血液科，广州 510630;基金项目：本课题为广州市科技计划项目，编号:2002Z3-E0012

　　【摘要】本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞(DC)，分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，以探讨其对白血病Jurkat细胞的杀伤作用。联合应用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC。实验分4组：冻融抗原致敏DC组为实验组A，WT1多肽致敏DC组为实验组B，未致敏DC组为对照组A，单核细胞组为对照组B，观察CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。结果表明：培养出了具有典型特征的DC，它高表达CD40、CD80、CD1a 及CD86等表面标志，能体外诱导强烈的同种异基因混合淋巴细胞增殖反应。实验组显示高水平杀伤率，与对照组比较均具有统计学意义(P<0.01)，实验组A、B间比较无统计学意义。结论：Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC能有效诱导T细胞抗白血病作用，为临床研制DC疫苗提供了实验依据。
　　【关键词】 树突状细胞; Jurkat细胞; 冻融抗原; WT1多肽抗原;细胞毒作用;白血病
　　Antigen-loaded Dendritic Cells Trigger Killing Effects of Specific Cyto-toxic T Lymphocytes on Jurkat Cells In Vitro　LIN Dong-Jun，FANG Zhi-Gang，LI Xu-Dong，LIU Jia-Jun，LU-Ying　Department of Hematology，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

　　Abstract This study was aimed to investigate the effects of tumor antigen-loaded dendritic cells (DC) stimulating the specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) on Jurkat cells in vitro. Peripheral blood mononuclear cells were isolated by Ficoll density gradient centrifugation from normal human heparinized blood，the adherent monocytes were cultured with granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)，interleukin-4 (IL-4)，alpha tumor necrosis factor (TNF-α) and sCD40L，DCs were co-cultured with frozen-thawed antigen of Jurkat cells or WT1 peptides，and then T cells were triggered into specific CTL. The results showed that most suspended cells exhibited distinctive morphological features of DC which expressed CD40 (96%)，CD86 (97%)，CD80 (77%)，CD1a (69%)，and gained the powerful capacity to stimulate proliferation of allogeneic lymphocytes. Under the effector ∶target ratio of 20∶1，CTLs derived from cultures with DC and frozen-thawed antigen of Jurkat cells showed 91.1% cytotoxicity against Jurkat cells，CTL derived from cultures with DC and WT1 peptides showed 87.5% cytotoxicity against Jurkat cells，cytotoxicity of CTL derived from cultures with unloaded DC against Jurkat cells was 42.1% and cytotoxicity of monocytes was 22.7%. Cytotoxicity of CTL derived from culture with frozen-thawed antigen or WT1 peptides loaded DC was stronger than that in control groups(P<0.01). It is concluded that the tumor antigen-pulsed DC can induce efficient and specific anti-tumor immunity，may play a great role in clinical therapy for leukemia.

　　Key words dendritic cell; Jurkat cell; frozen-thawed antigen ;WT1 polypeptide; cytotoxicity; leukemia

　　树突状细胞(dendritic cell，DC)是已知体内功能强的专职抗原呈递细胞，大特点是能刺激初始型T细胞活化和增殖，是特异性免疫应答的始动者，DC在抗肿瘤免疫反应中起关键作用。但大多数白血病患者有DC功能缺陷，在体外扩增DC并诱导白血病特异性细胞毒性T细胞发挥大限度特异性抗白血病效应，使消除白血病病灶、延长患者寿命、防止复发成为可能。本实验应用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等由健康人外周血单核细胞(monocytes)诱导活化出DC，使其分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原(Wilms tumor antigen，WT1 )，体外诱导产生特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，观察CTL对Jurkat细胞的特异性杀伤效应，为DC疫苗在白血病免疫治疗中的临床应用提供实验依据。
　　材料和方法
　　主要试剂及仪器
　　rhGM-CSF、 rhIL-4、rhTNF-α、rhsCD40L均购自美国 Cytolab公司; 鼠抗人FITC-CD14、CD1a、CD40、CD80、CD83、PE-CD86等流式细胞荧光标记抗体(美国eBioscience公司产品);LDH-Cytotoxicity 分析(美国Biovision公司产品);Nikon TE 2000-U 倒置显微镜(日本Nikon产品);Model 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司产品); FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司产品)。急性T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat)为WT1基因(+)细胞系(本院血液室保存，RT-PCR检测WT1基因阳性)。
　　单核细胞来源的DC的体外诱导培养及鉴定

　　采集新鲜抗凝健康人外周血，用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(mononuclear cells)，以含10%胎牛血清(FBS) 的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为3×109/L，接种于25 ml塑料培养瓶，在 5% CO2饱和湿度、37℃条件下孵育3小时，吸出非黏附细胞，用预热的培养液洗去未贴壁的细胞，即获得贴壁的单核细胞(monocytes)。加入含10% FBS 的RPMI 1640培养液(含rhGM-CSF 100 μg/L，rhIL-4 50 μg/L，2 mmol/L L-谷氨酰胺)，在5% CO2、37℃条件下培养，第3、5天半量换液，同等量添加上述细胞因子，在第5天收集悬浮细胞于6孔板培养，并添加rhTNF-α 20 μg/L，rhsCD40L 2 mg/L。第7天收获细胞，瑞氏染色并摄片，流式细胞仪检测免疫表型。
　　混合淋巴细胞反应(MLR)

　　收集上述方法中获得的非贴壁单个核细胞(淋巴细胞)，加入RPMI 1640(含rhIL-2 20 000 U/L低浓度培养)，每2-3天半量换液，培养7天作为反应细胞;刺激细胞为向DC诱导的细胞，收集培养第7天的DC悬液，离心。同种异基因混合淋巴细胞反应组为实验组，与同种同基因淋巴细胞反应组为对照组。MTT法检测淋巴细胞增殖活性：DC与淋巴细胞比例分别为1∶10，1∶20，1∶100(淋巴细胞浓度为2×109/L)，各0.1 ml接种于96孔板，混和孵育72小时，加 MTT 10 μl(5 μg/L)再作用4小时，酶标仪检测波长490 nm的A值。
　　Jurkat细胞冻融抗原制备和WT1多肽合成及抗原冲击致敏DC

　　收集Jurkat细胞，生理盐水洗涤，调整细胞浓度为1×109/L，放置-70℃冰箱10分钟，37℃水浴复温，反复冻融5次，500×g离心10分钟，收集上清，10 000×g低温离心30分钟，取上清用0.22 μm微孔滤膜过滤，-20℃冰箱保存备用;选用WT1蛋白第126-134位9个氨基酸残基的多肽，氨基酸序列为RMFPNAPYL，由上海生工公司合成，HPLC纯度检测>95%，分子量1 108.3，取5 mg 溶于5 ml PBS中，分装，-20℃冰箱保存备用。在DC培养的第4天每毫升培养体系实验组分别加Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽50 μl，作用24小时，RPMI 1640培养液洗涤，重新添加细胞因子继续培养。
　　IL-12含量的检测及活化T细胞免疫表型检测
　　收集诱导培养的第7天DC上清，用ELISA法定量检测IL-12的含量，具体操作按试剂盒(法国 Diclone 公司产品)说明书进行。收集上述方法中分离获得的非贴壁异体单个核细胞，用含IL-2 20 000 U/L的RPMI 1640培养液培养7天，加DC继续诱导培养72小时，DC与淋巴细胞浓度比为1∶20。DC诱导的T细胞表型为实验组，未经DC诱导的T细胞表型为对照组，收集培养的细胞悬液，洗涤、离心后加PBS悬浮，加入CD3、CD4、CD8及CD28荧光抗体，用流式细胞仪检测。
　　细胞毒作用的乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定
　　收集上述方法培养的活化T细胞作为效应细胞，取传代后24小时的Jurkat细胞为靶细胞，效靶比为5∶1、10∶1、20∶1。实验分4组：实验组A：Jurkat细胞冻融抗原冲击致敏DC+异体淋巴细胞+ Jurkat细胞;实验组B：WT1多肽抗原冲击致敏DC+异体淋巴细胞+ Jurkat细胞;对照组A：未致敏DC+异体淋巴细胞+ Jurkat细胞;对照组B：单核细胞+异体淋巴细胞+ Jurkat细胞。LDH释放法测定细胞毒效应，按LDH-Cytotoxicity 试剂盒说明书操作，酶标仪检测波长490 nm处的A值，参考波长为630 nm。细胞杀伤活性计算：细胞毒(%)=[(实验组A值-低控组A值)/(高控组A值-低控组A值)]×

　　统计学处理
　　SPSS 11.0软件进行统计学分析，数据用(X±SD)表示，两组资料采用t检验，P<0.05为有统计学意义。
　　结果

　　外周血DC的诱导扩增及鉴定

　　培养48小时后，悬浮细胞增多，第4-5天，多数细胞呈悬浮生长，并聚集成团，细胞体积明显增大，圆形或不规则形，表面有毛刺样突起。第7天悬浮细胞较散在分布，细胞体积大，毛刺、树枝样突起增多、变长(图1A)。瑞氏染色RG 可见细胞体积大，直径约15-35 μm，呈圆形、不规则形，表面有伪足样突起(图1B)。流式细胞仪检测CD86达97%，CD40达96%，CD80平均为77%，CD1a平均为64.62%，CD83平均为40%，而单核细胞特征性标志CD14<5%(图2)，表明经细胞因子诱导后绝大部分单核细胞转变成了DC。
　　混合淋巴细胞反应结果

　　结果见表1。DC与同种同基因或同种异基因淋巴细胞按不同比例混合都可产生增殖反应，1∶20，1∶10比例下，两组比较均具有统计学意义(P<0.05)。在1∶10时增殖反应强，这表明经细胞因子诱导得到的DC具有强的免疫原性，具有更强的刺激同种异基因淋巴细胞增殖反应的能力，且随着DC细胞数的增多，刺激同种异基因淋巴细胞增殖反应的能力增强。Table 1. Proliferative response after mixture of DC with autogeneic and allogeneic lymphocytes (略)

　　活化T细胞免疫表型及IL-12的含量
　　检测结果见表2。由表2可见经DC激发的T细胞有明显上调CD3、CD4、CD8、CD28分子的作用(因检测例数少，未进一步作统计学分析)。ELISA法定量检测IL-12的含量为61 μg/L。Table 2. Phenotype of T lymphocytes effected by DC(略)

　　致敏DC诱导CTL细胞毒作用的观察

　　用LDH释放法检测CTL的细胞毒效应，结果见表3。用配对t检验，对实验组A、实验组B及对照组A、对照组B在各不同效靶比下的杀伤率作两两比较，在任一固定效靶比例下，实验组A、B与对照组A、B两两比较，差别均具有统计学意义(P<0.01)。实验组A、B间两两比较(P>0.05)不具有统计学意义。这些结果表明，经抗原致敏DC能显著增强CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。Table 3. Frozen-thawed antigen and WT1 peptide-loaded DC triggering CTL mediated killing effects on Jurkat cell (略)

　　讨 论
　　近年来研究证实，DC被各种形式的肿瘤抗原致敏后可以在体内外诱导出肿瘤特异性CTL[1-5]，目前利用DC进行肿瘤免疫治疗已进入临床试验阶段。GM-CSF与IL-4联合应用可诱导单核细胞成为具有未成熟表型的DC，再予一定的刺激信号作用，如TNF-α、CD40L等细胞因子，可诱导出成熟DC，使其抗原呈递功能达到佳状态。CD40L是人类DC成熟重要刺激信号，sCD40L在体外不仅具有显著的诱导DC分化、促进DC成熟的功能，而且经sCD40L作用的DC能更有效地激发T细胞[6]，sCD40L有希望成为制备高效DC疫苗的重要细胞因子。CD40L与DC表面的CD40相互作用后能诱导DC的分化成熟[7-9]，上调共刺激分子的表达，且CD40-CD40L的相互作用诱导DC分泌一系列细胞因子和趋化因子，如IL-12、TNF-α、MIP-α等。IL-12主要来源于DC的分泌，其功能主要是控制CD4+T细胞向Th1细胞亚群的分化，诱导产生INF-γ，在体液抗肿瘤免疫方面发挥重要作用。
　　1990年Call 等[16]从Wilms瘤细胞中分离出WT1基因，其基因定位于染色体11P13，编码复杂的mRNA，由于其2个可变连接区的变化，可产生4种不同的转录产物。近年来研究发现，在正常造血系统及造血系统恶性肿瘤中WT1基因有不同表达，在多种实体瘤如乳腺癌、肺癌等中高表达。采用RT-PCR技术检测WT1基因的表达，发现在AML、 ALL及CML急性变中有高表达[11，12]。WT1多肽是已经鉴定出的白血病多肽。Ohminani等[9]用WT1多肽致敏T细胞后，后者对HLA-A24阳性白血病细胞株具有特异性的细胞毒作用。WT1多肽致敏的DC通过诱导细胞毒T细胞对表达WT1基因的急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合征和实体瘤等肿瘤细胞产生杀伤效应，故可用于白血病、实体瘤的免疫治疗[13-15]。
　　我们从健康人外周血中分离出单核细胞，经诱导培养出具有典型树突状形态特征的DC，它高表达CD86(高达97%)、D80、CD40(高达96%)及CD1α，表达CD83平均为40%，混合淋巴细胞反应提示其具有极强的免疫原性。在DC培养至未成熟阶段，用Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原致敏DC，继而加入TNF-α、sCD40L，使DC趋于成熟，诱导激活T细胞，引起特异性抗肿瘤效应。冲击致敏DC诱导激发的CTL在冻融抗原及WT1多肽抗原不同效靶比下对Jurkat细胞的杀伤率均高于单纯DC组和单核细胞对照组(P<0.05)，且在每一组中，它们所激发的CTL杀伤活性均随着效靶比的提高而相应提高，显示了杀伤活性的量效关系，说明DC已成功摄取了冻融抗原或WT1多肽抗原，加工后经MHC类分子呈递给淋巴细胞，同时通过共刺激分子、黏附分子等将T细胞激活，对白血病细胞产生了特异性杀伤作用。其中未致敏DC、单核细胞组表现出一定的杀伤效应，它们对白血病细胞是非特异性杀伤，所以效率较低。实验组A、B间两两比较(P>0.05)不具有统计学意义，可见WT1多肽抗原(单一肿瘤细胞特异性抗原)与Jurkat细胞冻融抗原(获得全肿瘤细胞抗原)所激活的CTL对Jurkat靶细胞杀伤效应相当，这也不失为有效负载肿瘤抗原的方法，此两种方法都具有临床应用价值，为进一步应用于免疫治疗的体内实验奠定了基础。我们只合成其中一种WT1多肽负载DC，至于其它3种多肽抗原负载DC能否诱导出更强的CTL，尚需进一步研究。已知的抗原不一定能诱导出佳抗肿瘤免疫反应。一种抗原负载DC，其优点在于诱发的免疫反应特异性强，但是诱发的仅是单一克隆的CTL，效果有限，存在诱发抗原调变的危险。冻融抗原所获取的抗原信息量大，可提供多种已知和未知肿瘤特异性或相关性抗原，诱导T细胞多克隆扩增，避免发生某些变异株的免疫逃逸，保证抗肿瘤免疫的全面性和强效性;缺点是特异性抗原纯度底，对DC的负载效果相对较不特异。虽然Jurkat细胞冻融抗原和WT1多肽抗原冲击致敏DC激活CTL，体外对Jurkat细胞产生明显杀伤效应，但是在体内效果如何有待进一步研究。