复元胶囊对衰老性骨关节炎模型兔血清氧自由基代谢及血液流变学的影响

作者：牟方政,李荣亨,张文亮,肖彩芝　　作者单位：重庆医科大学附属医院中西医结合科，重庆 400016

　　【摘要】目的观察复元胶囊对衰老性骨关节炎模型兔血清总超氧化酶歧化物(TSOD)、丙二醛(MDA)以及血液流变的影响。方法 52只健康新西兰大白兔随机分为正常组、模型对照组、模型组、奥泰灵组、复元胶囊低剂量组、复元胶囊中剂量组及复元胶囊高剂量组。模型对照组右后肢伸直石膏固定，模型组在模型对照组基础上颈背部皮下注射D半乳糖。各药物组用灌胃方式给药6 w。酶标仪检测血清TSOD和MDA光密度，计算TSOD活力和MDA浓度。全自动血液流变分析仪测全血黏度。结果 造模6 w后，模型组与模型对照组关节软骨出现典型骨关节炎病理改变。模型组血清TSOD活力降低和MDA浓度升高，与正常组和模型对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，与正常组比较，血黏度指标不同程度升高，差异有统计学意义(P<0.05)。用药6 w后，复元胶囊各组与模型组比较，软骨病理改变减轻，TSOD活力增强，MDA浓度降低，差异有统计学意义(P<0.05);血黏度指标变化，差异无统计学意义(P>0.05)。复元胶囊高剂量组与低、中剂量比较，TSOD和MDA变化差异有统计学意义(P<0.05)。结论 复元胶囊不能改善模型兔血液黏度，但能够抑制氧自由基过度生成，起到延缓衰老，保护软骨的作用。
　　【关键词】 骨关节炎;补肾;益气活血;复元胶囊;氧自由基;血液流变
　　【Abstract】 ob[x]jective To observe the influence of Fuyuan capsule on serum total superoxide dismutases (TSOD) and malondialdehyde (MDA), hemorheology in replicative senescence osteoarthritis model rabbit. Further to explore the therapeutic mechanism of osteoarthritis by Fuyuan capsule. Methods Fiftysix healthy New Zealand big rabbits were randomly divided into normal, model control , model, glucosamine hydrochloride , different dose Fuyuan capsule groups. In model control group, the right hind limbs were fixed by plaster bandage in the straight situation. The model group was established by cervicodorsal hypodermic Dgalacitiol on the basis of model control group. Drug groups were respectively fed with glucosamine hydrochloride and Fuyuan capsule one times daily for six weeks. Serum TSOD level and MDA light density were detected by microplate reader, then the activity and concentration were calculated. Whole blood viscosity were tested with automatic measurement of blood rheology analyzer. Results After six weeks, in model and model control groups, the characteristics of osteoarthritis pathological changes of articular cartilage were seen. Compared with those of normal and model control groups, the serum TSOD activity of model group was reduced and MDA concentration was increased (P<0.05). There was significant difference in blood viscosity indexes between normal group and model group(P<0.05). The difference had statistical significance between different dose Fuyuan capsule groups and model group in the cartilage pathological changes. Compared with that of model group, the serum TSOD activity was increased, while the contents of MDA was lowered markedly after therapy in Fuyuan capsule groups (P<0.05). There was not statistical significance in the change of blood viscosity indexes between Fuyuan capsule groups and model group (P>0.05). The levels of TSOD and MDA in Fuyuan capsule highdosage group had statistical significance with lowdosage and middledosage groups (P<0.05).Conclusions Fuyuan capsules can not improve blood viscosity, but can inhibit overproduction of oxygen free radical, retard aging, play an important role in the prevention and treatment of osteoarthritis.

　　【Key words】 Osteoarthritis;Nourishing kidney; Enriching qi and activating blood; Fuyuan capsules; Free radicals; Hemorheology

　　骨关节炎(OA)是老年人常见的关节疾病和慢性致残的主要因素，OA的病因十分复杂，发病机制未明，且缺乏有效治疗手段。OA患者体内存在氧自由基含量和血黏度变化，目前普遍认为用中药复方制剂清除体内过剩氧自由基，降低血液黏度，为防治衰老性OA提供了研究途径。前期研究表明〔1，2〕，复元胶囊具有抑制炎症细胞因子、软骨细胞凋亡的作用。本文采用皮下注射D半乳糖联合右后肢膝关节伸直石膏固定法制作衰老性膝关节OA兔模型，检测模型兔血清氧自由基清除剂总超氧化物歧化酶(TSOD)活力、毒性代谢产物丙二醛(MDA)浓度以及血液黏度，探讨复元胶囊防治膝关节OA的其他作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　健康新西兰兔(重庆医科大学实验动物中心提供)52只，雌雄各半，体重(2.5±0.5) kg。合格证：SCXK(渝) 20090001。
　　1.1.2 实验药物

　　实验药物复元胶囊由鹿茸、淫羊藿、生晒参、黄芪、丹参等组成，重庆希尔安药业有限公司生产，科研批号(2005B18)。每粒胶囊重0.41 g，相当于生药3 g，仅供实验使用。对照药物奥泰灵由香港澳美制药公司生产(批号：国药准字Z20081011)，规格为每粒含盐酸氨基葡萄糖750 mg。
　　1.1.3 主要仪器

　　酶标仪(Thermo Scientific 全波长酶标仪)、微量移液器、水浴箱、冰箱、离心机、试管，全自动血液流变测定仪、真空抗凝采血管,光学显微镜。以上仪器由重庆医科大学附属一院中心实验室提供。
　　1.1.4 主要试剂

　　冰醋酸、无水乙醇、双蒸水由实验室提供。SOD试剂盒(2009001) 和MDA试剂盒(2009002)均由南京建成生物工程研究所提供。D半乳糖由美国Amerisco公司提供。
　　1.2 方法

　　1.2.1 分组

　　52只新西兰兔随机分为正常组、模型对照组、模型组、奥泰灵对照组、复元胶囊低剂量组、复元胶囊中剂量组、复元胶囊高剂量组。每只均单笼饲养。动物分组以及饲养方法。见表1。表1 动物分组以及饲养方法

　　1.2.2 造模

　　所有实验动物同等条件下适应性饲养1 w后，模型对照组采用伸直制动法建模〔3〕：先剪去兔子右后肢踝关节以上的兔毛，用医用纱布裹上两层，再用管型石膏将其伸直位固定，石膏外以透明胶纸封好，以防兔撕咬，若石膏松动或脱落者及时重新固定，时间6 w，造成单纯性OA模型。模型组在模型对照组的基础上颈背皮下注射D半乳糖30 mg·kg-1·d-1，时间6 w，造成衰老性〔4〕OA模型。
　　1.2.3 给药

　　造模后第1周开始分组给药。根据MeehRuber公式计算兔的给药剂量，饮用水溶解后灌胃，均每日定时一次性给药，用药6 w。
　　1.2.4 观察指标

　　1.2.4.1 一般情况
　　观察兔子精神状况、毛发、局部淤血轻重及关节灵活度等。
　　1.2.4.2 SOD活力和MDA浓度检测
　　用药6 w后取标本：将兔断颈处死取血2 ml，经4 000 r/min离心后，取血清于-20℃低温冰箱中保存待测。采用羟胺法测定SOD活力，硫代巴比妥(TBA)法测MDA浓度。按SOD测定试剂盒步骤说明操作，确定有效取样量为10 μl，待测样在波长550 nm光下用酶标仪测定吸光度(A)，根据公式测定TSOD活力=〔(对照管光密度-测定管光密度)÷对照管光密度〕×662 U/ml。按MDA测定试剂盒步骤说明操作,取血清0.1 ml，待测样在波长532 nm光下用酶标仪测定其吸光度(A)，根据公式MDA浓度=〔(测定管光密度-测空管光密度)/(标准管光密度-标空管光密度)〕×标准品浓度(10 nmol/L)，计算MDA浓度。
　　1.2.4.3 血液黏度检测
　　用真空抗凝管取血3 ml，轻轻摇动采血管。在相同外界条件下，即时送检。采用全自动血液流变分析仪，检测各组全血黏度高切(mpas200/s)、全血黏度低切(mpas3/s)、红细胞刚性指数(TK)、红细胞电泳时间(tRBC)。
　　1.2.4.4 组织学检查
　　用药6 w后，处死家兔，立即切取家兔胫骨平台内侧关节面的完整软骨及软骨下骨组织标本，用10%的甲醛溶液固定48 h，脱钙2～3 d，石蜡纵向包埋固定，常规切片，苏木素伊红(HE)染色。在光学显微镜下镜检各组动物的病理切片，观察软骨的病理改变。
　　1.3 统计学分析
　　应用SPSS13.0统计分析软件处理，数据结果以x±s表示，单因素方差分析，两组间比较用q检验。
　　2 结 果
　　2.1 一般情况
　　模型对照组和模型组较正常组精神差，毛发光泽度下降，关节活动不利，制动右后肢局部不同程度淤血。奥泰灵组与模型组无明显差别。复元胶囊各组较模型组精神好，活泼爱动，毛发光泽度尚好，关节灵活度增大，淤血明显减轻。
　　2.2 病理切片观察

　　肉眼观察正常组膝关节面光滑呈淡蓝色;模型对照组和模型组动物关节软骨面不光滑，颜色暗淡，呈磨砂玻璃样;奥泰灵组关节软骨面欠光滑，颜色灰暗;复元胶囊各组关节软骨面淡红，比较光滑，高剂量组尤甚。病理切片采用HE染色，观察发现正常组动物关节软骨细胞排列均匀，无增生，软骨面光滑;模型对照组和模型组关节软骨切线层大部分缺失，移行层受损，软骨细胞排列不均，并大量簇聚，毛细血管侵入软骨下骨并部分突破潮线。奥泰灵组软骨切线层破坏，细胞簇聚，双重潮线。复元胶囊各剂量组软骨表层比较规则，细胞排列相对均匀，散在肥大，且高剂量组较低剂量佳。
　　2.3 各组TSOD活力及MDA浓度比较

　　模型对照组与正常组比较，TSOD活力降低，MDA浓度升高(P<0.05)。模型对照组与模型组比较，TSOD活力、MDA浓度差异有统计学意义(P<0.05)。复元胶囊各剂量组与模型组和奥泰灵组比较，TSOD活力升高，MDA浓度降低(P<0.05)。复元胶囊高剂量与低剂量比较，TSOD活力升高，MDA浓度降低(P<0.05)。见表2。表2 各组血清TSOD活力、MDA浓度比较

　　2.4 各组血液黏度比较
　　模型对照组与正常组比较，反映红细胞聚集能力的低切黏度和红细胞电泳时间，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与模型对照组比较，反映红细胞变形能力的高切黏度和红细胞刚性指数，差异有统计学意义(P<0.05);与正常组比较全血黏度都升高，差异有统计学意义(P<0.05)。复元胶囊各组与模型组比较，血黏度变化，无统计学意义(P>0.05)。复元胶囊中剂量组与低、高剂量组比较，反映红细胞聚集能力的指标，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。表3 各组血液黏度比较
　　3 讨 论
　　3.1 造模评价

　　OA系多种病因所致关节软骨的退行性变，与衰老和运动失度关系密切。本实验采用伸直制动兔右后肢，让其运动不足，并结合颈背部皮下注射D半乳糖，制作衰老性OA模型。皮下注射D半乳糖制作衰老模型，广泛用于药物防治衰老的实验研究。有研究表明〔4〕皮下注射D半乳糖6 w后可以造成亚急性衰老模型，动物血清和红细胞中SOD活力下降，MDA浓度增加，可用于抗氧化等方面的抗衰老药效研究。关节伸直制动造成单纯性OA模型，更能够反映OA形成的自然属性。纪斌平〔5〕等认为膝关节伸直制动，改变了关节的力学和生物学平衡，引起关节软骨的破坏和代偿性修复、增生，这可能是制动造模的原理所在。张洪等〔6〕将28只成年新西兰大白兔的左后肢膝关节伸直位石膏管形固定，观察其左后肢膝关节软骨病理改变。结果显示6 w后无论从大体还是镜下以及细胞凋亡情况，兔左后肢膝关节均呈典型的OA特征，因此认为膝关节伸直位制动5～6 w是一个制作OA动物模型的较为理想的方法。在单纯性OA基础上增加衰老因素，采用这种方式造模6 w后，模型组软骨符合OA病理改变，同时整体抗氧化能力也下降，说明这种造模方法基本符合临床OA的发生机理，诱导成功率高，应用广泛，特别适用于对预防或减轻衰老性OA的药物研究。
　　3.2 自由基与OA OA是一种与衰老密切相关的疾病。目前研究认为衰老的主要理论是自由基损伤学说，自由基的过度生成，造成细胞、组织、器官损伤，出现功能衰退现象。自由基对关节软骨的损伤主要表现在对软骨细胞和软骨基质损伤两个方面。有研究〔7，8〕认为OA病理状态下血清和关节液氧自由基含量增高，过量的氧自由基可抑制软骨细胞的增殖，引起软骨细胞死亡，抑制软骨基质蛋白多糖和胶原的合成，加速软骨基质的降解，导致软骨损伤。SOD活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力，MDA浓度的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。二者可作为动态评价衰老性疾病防治效果的客观指标。本实验中结果表明，在模型组和模型对照组中血清TSOD活力降低，血清MDA浓度升高，说明自由基参与了衰老性OA整个疾病过程。
　　3.3 血液黏度与OA 血黏度指标中，全血高切、红细胞刚性指数反映红细胞的变形性;全血低切黏度、红细胞电泳时间反映红细胞的聚集性。OA血液循环状态不良，局部瘀血或缺血，影响软骨细胞的增殖，基质合成减少，也是加速软骨退变的重要原因。杨霖等〔9〕对OA患者采用多因素分析平衡年龄和性别因素后，结果显示膝关节OA组的红细胞变形指数和刚性指数高于对照组。本实验采用伸直制动办法，可以导致关节局部瘀血或缺血，这也会影响到软骨营养供给，促成OA模型形成。实验表明，模型对照组存在红细胞聚集性增强，这一结果与人膝关节OA血黏度存在不一致的地方，可能与实验对象和影响因素有关，就其原因还有待于进一步研究。模型组与模型对照组比较，全血高切值和刚性指数升高，说明D半乳糖影响单纯性OA血清红细胞变形能力。模型组较模型对照组兔血液黏度各指数值都增加,说明衰老性OA存在高黏血状态。
　　3.4 复元胶囊治疗OA OA相当于祖国医学“骨痹”“痿症”范畴。中医认为本病的发生多由于肝肾亏虚，气血不足，风寒湿邪侵入骨骼，以致血瘀阻经络，运行失畅所致。衰老性OA病机以肝肾亏虚为本，血脉不利为标。治宜补益肝肾，益气活血。复元胶囊由鹿茸、淫羊藿、丹参、生晒参、黄芪等中药经科学配伍而成，具有益肾壮骨、行气活血之效。有文献报道〔10～12〕，鹿茸、淫羊藿、黄芪、丹参能够清除机体过量自由基，抑制脂质过氧化产物生成，起到抗氧化，延缓衰老性疾病的作用。本实验证明复元胶囊能够增强衰老性OA血清TSOD的活力，降低MDA浓度，并且存在剂量依赖性。复元胶囊对衰老性OA兔血液黏度指标总体上无明显改善，甚至还有加重的趋势。不过，随着复元胶囊剂量加大，反映红细胞聚集性的指标出现先升高后降低，这说明复元胶囊对红细胞聚集状态有双向调节作用，这种原因可能与复元胶囊以补肾为主，活血力量偏弱有关，其具体作用机制，还有待于进一步研究。相反，这或许应用于低黏血症，能够起到很好的疗效。
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