CD4+、CD25+调节性T细胞在重型乙型肝炎发病中的作用

作者：周正仕,张伦理　　作者单位：324000 浙江省衢州市人民医院

　　【摘要】 目的 探讨CD4+、CD25+调节性T细胞(CD4+、CD25+ Tr)在重型乙型肝炎病人发病机制中的作用。 方法 采用流式细胞术检测重型乙型肝炎病人及对照组外周血CD4+、CD25+ Tr 的水平及应用PCR测定重型乙型肝炎病人及对照组外周血中HBVDNA滴度。 结果 重型乙型肝炎组外周血CD4+、CD25+ Tr的百分率为(2.63±0.83)%，较慢性乙型肝炎组的(4.15±1.17)%差异有显著性(P<0.05)，较无症状HBV携带者组及健康对照组差异有非常显著性(P均<0.01);重型乙型肝炎组外周血HBVDNA滴度为1.2×104 copies/ml，较慢性乙型肝炎组(2.3×106 copies/ml)和无症状HBV携带者(7.8×105 copies/ml)差异有非常显著性(P均<0.01);不同乙型肝炎病人外周血CD4+、CD25+ Tr的百分率与HBVDNA滴度正相关。结论 CD4+、CD25+ Tr能抑制T细胞对HBV的免疫反应;重型乙型肝炎患者发病与CD4+、CD25+ Tr表达过低有关。
　　【关键词】 CD4+、CD25+调节性T细胞 重型乙型肝炎 CD8+T细胞反应

　　【Abstract】ob[x]jective To explore the possible role of CD4+、CD25+ regulatory T cells in the pathogenesis of severe hepatitis B. Methods The frequency of CD4+、CD25+ Tr in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from hepatitis B patients and healthy controls were detected by flow cytometry and their HBVDNA serum levels were detected by PCR. Results 1. A lower proportion of CD4+、CD25+ Tr in PBMCs was found in severe hepatitis B patients(mean%,2.63 ± 0.83)when compared with chronic hepatitis B patients(mean%,4.15 ±1.17, P<0.05) , chronic asymptomatic HBV carriers(P<0.01) and healthy controls (P<0.01) 2.There were significant differences on HBVDNA serum levels of Severe hepatitis B patients(1.2×104 copies/ml) when compared with chronic hepatitis B patients( 2.3×106copies/ml，P<0.01) , chronic asymptomatic HBV carriers (7.8×105copies/ml，P<0.01) 3.Correlation analysis showed that there was positive correlation between HBVDNA serum levels and the frequency of CD4+、CD25+ Tr in PBMCs in hepatitis B patients. Conclusions CD4+、CD25+ Tr could suppress T cell response against hepatitis B virus and the low ex[x]pression of CD4+、CD25+ Tr in PBMCs is correlated with pathogenesis of severe hepatitis B.

　　【Key words】 CD4+、CD25+ Regulatory T Cells severe hepatitis B CD8+ T cell response

　　HBV感染所诱导的细胞免疫反应是机体清除HBV的主要方法，但免疫反应过强，在清除HBV的同时易造成广泛的肝细胞坏死和凋亡，从而诱发出重型肝炎。然而重型乙型肝炎患者细胞免疫反应过度的原因迄今尚不清楚,故探讨其反应过度对阐明重型乙型肝炎的发病机制具有重要意义。CD4+、CD25+ 调节性T细胞(CD4+、CD25+ Tr)具有免疫抑制功能的一类T细胞亚群，它的激活及其数量的高低直接影响到细胞免疫反应的强弱，这在自身免疫性疾病和移植免疫中已得到证实。因此研究CD4+、CD25+ Tr在重型乙型肝炎中的分布和作用，由此探讨其在重型乙型肝炎患者细胞免疫过度中的意义，将有助于阐明重型乙型肝炎的发病机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 研究对象

　　全部病例均为江西医学院一附院感染科2004年5月至2005年5月门诊及住院患者。其中：重型乙型肝炎30例，男21例，女9例，年龄15～42岁，平均(26.41±6.29)岁;慢性乙型肝炎20例，男13例，女7例，年龄16～52岁，平均(29.2±7.45)岁;无症状HBV携带者20例, 男14例，女6例，年龄15～45岁，平均(27.8±6.68)岁。均符合2000年西安会议《病毒性肝炎防治方案》所定的诊断标准[1]。所有病例均未合并其他嗜肝病毒感染或其它慢性疾病,均未应用拉米夫定、干扰素、胸腺肽、免疫球蛋白和乙肝疫苗接种等治疗。另取10例门诊体检者为健康对照组，也未进行过乙肝疫苗接种，其中男7例，女3例，年龄16～34岁，平均(24.8±5.35)岁。
　　1.2 标本采集及制备
　　于上午7：00～10：00 采集2 ml肘静脉血二份，EDTA抗凝，分别送往流式细胞仪室和PCR室。CD4+、CD25+ Tr测定：取专用试管2支，分别加入IgG-FITC、IgG-PE、IgG-PercpCD45、CD25-FITC、CD4-PE、CD45 Percp(上述试剂购自美国Caltag公司)各5ml，立即加入EDTA抗凝血100μl并充分混匀后，室温(20℃～25℃)避光放置15min，每管加溶血剂2ml，充分混匀后，室温(20℃～25℃)避光放置10min，离心弃上清液，用PBS洗涤2次后，加入PBS 0.5 ml( 4℃)待测。24h内用流式细胞仪(美国BECTON DICKINSON公司生产)检测，采用CellQuest软件获取数据和分析， 以CD45-SS设门，分析门内CD4+、CD25+细胞亚群，结果以CD4+、CD25+胞占CD4+、 细胞的百分率来表示。HBV DNA测定：由江西医学院一附院PCR室检测，操作规程相对固定。
　　1.3 统计学处理
　　采用SPSS 10.0统计软件，以(x±s)表示，进行t检验和直线相关分析。以P<0.05为差异有显著性。
　　2 结果

　　2.1 CD4+、CD25+ Tr分布情况比较

　　重型乙型肝炎组外周血的CD4+、CD25+ Tr占CD4+T细胞百分率为(2.63±0.83)%，较慢性乙型肝炎组的(4.15±1.17)%差异有显著性(P<0.05)，比无症状HBV携带者组的(8.32±2.72)%及健康对照组的(8.10±2.65)%，差异均有非常显著性(P均<0.01)。
　　2.2 血清HBVDNA的水平比较
　　重型乙型肝炎组外周血HBVDNA滴度1.2×104 copies/ml，较慢性乙型肝炎组的2.3×106 copies/ml和无症状HBV携带者组的7.8×105 copies/ml差异均有非常显著性(P均<0.01) 。
　　2.3 CD4+、CD25+ Tr百分率与HBVDNA滴度相关分析

　　无症状HBV携带者CD4+、CD25+ Tr的百分率与HBVDNA滴度相关系数r=0.447,P<0.01;慢性乙型肝炎CD4+、CD25+Tr的百分率与HBVDNA滴度相关系数r=0.453,P<0.05;重型乙型肝炎CD4+、CD25+ Tr百分率与HBVDNA滴度相关系数r=0.482,P<0.01。表明不同乙型肝炎病人外周血CD4+、CD25+ Tr的百分率与HBVDNA滴度呈正相关。
　　3 讨论

　　HBV侵入人体后，未被单核-吞噬细胞系统清除的HBV到达肝脏或肝外组织，并在肝细胞内进行复制。作为外来抗原(尤其是HBcAg)易引起T细胞识别并激活免疫反应加以清除。乙型肝炎的肝细胞免疫病理损伤以T淋巴细胞毒反应为主，组织内浸润的优势淋巴细胞是CD8+细胞毒性T细胞(CTL)，它可通过二种不同机制杀伤HBV感染的靶细胞：一是分泌性膜溶解途径包括穿孔素和溶解酶，二是非分泌性受体介导途径包括Fas(CD95)。一小部分患者由于免疫系统的某种缺陷，CTL扩增失去控制，激起强烈的CD8+细胞毒性T细胞反应 ，导致大量的肝细胞坏死和凋亡，也就是重型乙型肝炎可能的发病机制[2]。
　　免疫耐受和免疫激活都是免疫系统基本的活动。耐受也是一种获得性的过程。当抗原呈递细胞(APC)呈递肽片断到T细胞受体(TCR)时，T细胞开始识别并开始了免疫耐受或免疫激活的选择。T细胞的活化不仅需要或依赖TCR介导，还需要共刺激信号，这为免疫系统调节TCR提供了多种可能。近年研究发现体内存在一个有独特免疫调节作用的T细胞亚群CD4+、CD25+ Tr，能抑制机体的免疫反应。T细胞反应过弱，难以达到清除HBV或其他外来抗原的目的;过强易造成靶细胞的损害。因而适当有效的调节以维持内部一个相对平衡状态乃为免疫系统所必需。一旦这种平衡被打破，机体就易遭受致命的打击。当抗原激活T细胞应答的同时，也使CD4+、CD25+ Tr得到活化。T细胞应答开始时需有CD28介导活化和扩增克隆。CD28介导共刺激反应能够调节静息T细胞反应的阈值;在提供有效CD28信号的情况下，T细胞活化所需的TCR的结合阈值就明显地下降;它能促进CD4+和CD8+ T细胞产生细胞因子，如使IL-2产量提高100倍;此外有可能使CD8+ T细胞分化到细胞毒性效应细胞的作用[3，4]。
　　Cabrera以及Firpi等[5]研究丙型肝炎病毒感染(HCV)患者体内CD4+、CD25+ Tr的免疫调节作用时，发现其能分泌IL-10和TGF-β(两者均为免疫抑制因子)。CD4+、CD25+ Tr介导抑制是剂量依赖型的且要求细胞接触。CD4+、CD25+ Tr数量与HCV RNA 滴度呈正相关，与肝炎活动强度呈负相关。清除CD4+、CD25+ Tr能促进丙肝特异性(HCV-specific)CD4+、 和 CD8+ T细胞增殖。CD4+、CD25+ Tr能以细胞— 细胞直接接触的方式抑制HCV-specific T 细胞反应，从而使HCV得以持续存在体内。
　　Franzese O等[6]通过四棱线虫实验分析CD4+、CD25+ Tr对乙肝特异性(HBV-specific)CD8+T细胞功能的影响，发现CD4+、CD25+ Tr能抑制HBV-specific CD8+T细胞介导的抗病毒免疫反应，且这种调节显然是非抗原特异性的。CD4+、CD25+ Tr百分率越高抑制作用越强。清除CD4+、CD25+ Tr能促进CD8+T细胞的扩增和CD8+T细胞产生更多的IFN-γ。本资料重型乙型肝炎组CD4+、CD25+ Tr的百分率低于慢性乙肝组，明显低于无症状乙肝病毒携带者及健康对照组。可能由于CD4+、CD25+ Tr数量的明显不足，极大降低了CD4+、CD25+ Tr的免疫抑制能力，反应性T细胞过度扩增，原有的免疫平衡机制被打破，反应性T细胞(主要是HBV-specific CD8+T细胞)不断攻击HBV感染的靶细胞，导致大量靶细胞变性、坏死;同时触发肝细胞的凋亡机制引起肝细胞大量凋亡。由于HBV-specific CD8+ T细胞应答过程中能诱导IFN-γ的产生，而IFN-γ又通过诱导宿主产生一些其他细胞因子来降解病毒mRNA，抑制病毒蛋白转录，抑制病毒增强子活性来达到清除HBV的目的。因而重型乙型肝炎患者外周血HBVDNA滴度呈现较低水平。无症状HBV携带者组外周血的CD4+、CD25+ Tr百分率高，对CD8+T细胞应答的抑制作用也就强，感染肝细胞的坏死和凋亡也少。IFN-γ的产生不足，未能触发有效的抗病毒机制，放任了HBV的复制，也就是HBV携带者组外周血HBVDNA滴度明显高于重型乙型肝炎组的原因，也可能是机体对HBV产生免疫耐受主要的原因。慢性乙型肝炎组外周血CD4+、CD25+ Tr的百分率居于两者之间，对CD8+T细胞应答产生一定的抑制作用，但还不够，小股肝细胞发生变性、坏死，乃至凋亡，同时HBV得到部分清除，但绵延不绝。肝细胞不断发生变性、坏死，肝脏逐渐缩小，肝小叶发生结构改变，终会导致肝硬化的发生。
　　目前对CD4+、CD25+ Tr认识还不充分明了。许多学者认为CD4+、CD25+ Tr能分泌IL-10和TGF-β，并通过它们抑制T细胞应答，但有的学者认为CD4+、CD25+ Tr分泌的IL-10和TGF-β量太少，不足以对T细胞应答产生影响，至多能参与对CD4+、CD25+ Tr本身增殖发挥抑制作用。近年来有提出用体内输注调节性T细胞的方式来控制机体对HBV过激免疫反应， 或者短期下调无症状HBV携带者CD4+、CD25+ Tr的数量激活免疫反应来清除HBV。
　　【参考文献】
　　1 2000年西安全国传染病寄生虫病学术会议. 病毒性肝炎防治方案(试行). 中华传染病杂志，2000,8(6)：324.

　　2 Maini MK. The role of virus-specific CD8+ cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection.J Exp Med， 2000，191(8):1269～1280.

　　3 W.E.保罗编，吴玉章译.辅助分子. 基础免疫学. 第4版.北京：科学出版社，2003.501～508.

　　4 Shevach EM，Shwvach EM, Mchugh RS, et al.Control of T cell activation by CD4+、CD25+ suppressor T cells. Immunol Rev,2001.182～185.

　　5 Cabrera R, Firpi RJ.An immunomodulatory role for CD4(+)、CD25(+) regulatory T lymphocytes in hepatitis C virus infection. Hepatology， 2004，40(5):1062～1071.

　　6 Franzese O. Modulation of the CD8+-T-Cell Response by CD4+、 CD25+ Regulatory T Cells in Patients with Hepatitis B Virus Infection. J Virol， 2005，79(6):3322～3328.