黄连素和牛磺酸对胰岛素抵抗大鼠脂肪组织PAIlmRNA表达的影响

　　作者：赵晓华,李兴,李丽,崔琳琳　　作者单位：山西医科大学第二医院，山西 太原 030001

　　【摘要】目的：观察黄连素与牛磺酸对胰岛素抵抗(IR)大鼠的协同治疗作用。方法：SD雄性人鼠，按体重随机分为正常组和造模组，造模组大鼠饲以特殊高脂饲料30 d，造成胰岛素抵抗动物模型;以二甲双胍为对照，经黄连素和牛磺酸分别及联合治疗30 d后，取血检测血糖、胰岛素、血脂等指标，计算(IR)敏感指数。运用RTPCR技术测定大网膜脂肪组织PAI1mRNA的表达。结果：采用特殊高脂饲料可以成功诱导胰岛素抵抗动物模型;黄连素和牛磺酸可分别提高胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感指数，降低TG，TC，LDLC，升高HDLC(P<0.05)，下调脂肪组织PAI1mRNA的表达;黄连素和牛磺酸的协同作用优于单独作用。结论：黄连素与牛磺酸协同具有降糖、降脂、提高胰岛素敏感性作用，阻断PAI1mRNA的过度表达的综合效应。
　　【关键词】 胰岛素抵抗 黄连素 牛磺酸 动物模型 Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制物
　　The effects of berberine and taurine on PAI1 mRNA ex[x]pression in epiploon adipose tissue of high fat rats model of insulin resistance(IR)

　　ZHAO Xiaohua，LI Xing，LI Li，CUI Linlin

　　(The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

　　Abstract ob[x]jective：To observe the effects of berberine and taurine on PAI1mRNA ex[x]pression in epiploon adipose tissue of high fat rats model of insulin resistance(IR).Methods：SD rats were divided into normal and model groups at random by weight.Model groups were fed with high fat diet for 30 days firstly，screened the rats whose ISI decreased as model rats and treated with berberine and taurine respectively and combinedly for 30 dyas.After treatment，using RTPCR to PAI1mRNA from adipose tissue，the products were obtained，once its seqence was verified，semiquantitative RTPCR employed to study its ex[x]pressions in adipose tissues of rats with different groups.The fasting plasma glucose，insulin，TG，TC and HDLC were performed in each groups.ISI was calculated.Results：The IR model rats were induced by high fat diet.The berberine and taurine group and combine group could significantly increase insulin sensitivity (P<0.05)，decrease the weight(P<0.05)，and decrease the ex[x]pression of PAI1mRNA (P<0.05) in model rats.Meanwhile TG，TC，LDLC decreased and HDLC increased.The parameters mentioned above in combine group was better than other groups.Conclusion：Application of combining berberine and taurine is effective in increasing insulin sensitivity IR in rats induced by highfat diet and decreasing the ex[x]pression of PAI1mRNA in adipose tissues.It had significant effect on changing the total effect of insulin resistance.

　　Key words insulin resistance;berberine;taurine;rats;PAI1mRNA

　　胰岛素抵抗(IR)是多种代谢相关疾病的共同土壤，对胰岛素抵抗机制探讨以及早期干预是近年来医学界研究热点[1]，脂肪组织作为新的内分泌器官与ER关系密切[2]。本实验通过经循证医学证实有明确改善IR的药物二甲双胍做标准对照观察黄连素和牛磺酸联合使用对IR大鼠脂肪细胞因子PAI1mRNA表达的影响，以探讨二者对IR的作用。
　　1 资料与方法
　　1.1 动物

　　清洁级SD大鼠60只，雄性，180～200 g，山西医科大学实验动物中心提供。
　　1.2 药物与制备
　　二甲双胍、盐酸黄连素：使用前由医科大学第二临床医院制剂室配制为9 g/L灭菌混悬液，制剂置于4℃冰箱保存。牛磺酸：按3%比例混于高脂饲料给药。
　　1.3 主要试剂与仪器
　　总RNA提取试剂，琼脂糖凝胶，游离脂肪酸试剂盒，自动核酸蛋白定量仪，PCR仪器，GDS8000凝胶成像分析仪，GS800光密度扫描仪。
　　1.4 造模方法及实验分组
　　按SD雄性大鼠60只，适应性喂养1周后，按体重随机分为正常组(8只)和造模组，造模组采用特殊高脂饲料[3]，脂肪热比为59%，其中猪油占39%，蛋白质热比为21%，碳水化和物热比为20%，饲养30 d后，测空腹血糖和空腹胰岛素，计算胰岛素的敏感指数[4];根据正常组ISI数值的均数加2倍标准差的值作为标准，小于该值的为造模成功者，共40只，其余剔除。成模大鼠按体重随机分层分为：模型组、二甲双胍组、黄连素组、牛磺酸组、黄连素加牛磺酸组，二甲双胍、黄连素均按156 mg•kg-1•d-1体重剂量制剂灌胃，牛磺酸混于饲料给药(在高脂饲料基础上添加3%牛磺酸)。正常组和模型空白组每日按15 mL•kg-1•d-1剂量灌服蒸馏水。各组均于每日8：00～9：00固定时间灌胃。
　　1.5 观测指标

　　大鼠眼内眦静脉窦取血筛选造模成功大鼠，称重。连续干预1个月后，禁食12 h，动物称重，清醒状态颈动脉采血离心取上清测指标空腹血糖、胰岛素、TC、TG、HDLC、LDLC。IAI数值按李光伟等[5]的方法计算：IAI=l/(FPG×FINS)的自然对数。
　　1.6 RTPCR方法

　　检测大网膜脂肪组织PAI1表达。
　　1.6.1 总RNA提取

　　每只大鼠于取血后使用DEPC水处理的灭菌器械迅速剖腹取大网膜脂肪组织，立即置灭菌EP管，标记后入液氮冷冻，深低温冰箱保存备用，对大网膜脂肪组织总RNA提取，据紫外分光光度计测定标本RNA吸光度，OD260/OD280值1.8～2.0进行纯度鉴定。
　　SD大鼠PAI1 cDNA序列与内对照磷酸丙糖脱氢酶(GADPH) cDNA序列通过美国国家生物医学中心(NCBI)检索获得。引物序列由Primer 5.0软件设计。
　　PAI1引物：5′ATGAGATCAGTACTGCGGACGCCATCTTTG3′，5′GCACGCAGATGGTGCTACCATCAGACTTGT3′，GAPDH引物：5′GGGTGGTCCAGTATTTCTTA3，5′CTGTGGCATGATGTCCTT3。
　　1.6.2 逆转录及PCR反应

　　各取RNA 5 μL进行逆转录，逆转录产物cDNA在PCR仪上进行扩增反应，反应条件：95℃预变性2 min，以94℃变性1 min、56℃退火1 min、72℃ 50 s共进行30个循环，72℃延伸10 min。
　　1.6.3 2%琼脂糖凝胶电泳
　　PCR反应后，取5 μL PCR产物加1 μL电泳缓冲液进行2%琼脂糖凝胶电泳，100 V电压电泳30 min。
　　1.6.4 扫描成像分析

　　对电泳结果用凝胶成像系统照相。用Blandleader3.0图像处理软件的光密度扫描仪扫描测定灰度值，终对条带进行A值测定，以PAI1与内参照GAPDH的A值之比值来表示PAI1表达量。
　　1.7 统计学方法
　　全部计量资料取±s;ISI数据先经过变量变换再进行统计描述与分析;两组均数比较用t检验;多组间比较用单因素方差分析，两两比较用q检验：多个实验组与对照组比较用Dunnettt检验。以P<0.05为统计学有显著意义，所有数据用SPSS10.0软件处理。
　　2 结 果
　　2.1 用药前后IR大鼠weight，FBG，FIN，ISI，TG及TC观察

　　2.1.1 造模后ISI统计分析结果(见表1)

　　与正常组比较，各模型组weight增加，FBG、FIN升高，ISI显著降低，造模成功。各模型组间检验指标无统计学差异。
　　2.1.2 干预后各组指标比较(见表2、表3)表1 干预前FBG、FIN、ISI结果表2 干预后各组FBG、FIN、ISI结果 表3 干预后各组TC、TG、HDLC、LDLC结果与模型组比较，各干预组ISI全部升高，说明各干预方法都能改善大鼠IR，联合组改善ISI效果优于其他3组。
　　高脂饲料60 d后，模型组体重、FBG，FIN，TG，TC进一步升高，LDLC升高，ISI进一步降低，表明胰岛素抵抗程度加重，HDLC与正常组比较无差异。
　　与模型组比，各干预组FBG、FIN、TG降低。黄连素组TC低于模型组，而二甲双胍组未能降纸TC。除了牛磺酸组外各干预组均出现体重下降，牛磺酸组减轻体重与模型组无差异。但同时牛磺酸组、联合组中HDLC高于模型组，与正常无差别。联合组降脂效果佳。
　　2.2 用药后对胰岛素低抗大鼠大网膜脂肪组织PAI1mRNA的影响(见表4)表4 干预后各组PAI1mRNA结果

　　组 别例 数 PALI正常组80.4610±1.880模型组80.9760±1.1881)2)二甲双胍组80.7540±1.0611)2)黄连素组80.7680±1.1651)2)牛磺酸组80.8000±7.5591)2)3)4)联合组80.6788±8.3451)2)3)4)5)1)与正常组比较P<0.05。2)与模型组比较P<0.05。3)与二甲双胍组比较P<0.05。4)与黄连素组比较P<0.05。5)与牛磺酸组比较P<0.05。
　　模型组与正常组比较，大鼠脂肪组织PAI1 mRNA表达水平显著增加，各干预组与模型组比较PAI1 mRNA表达水平下降，虽然黄连素不如二甲双胍，但与牛磺酸协同作用对下调该基因表达效果好。
　　3 讨 论
　　由于遗传和(或)高脂饮食、运动减少等因素引起肥胖，特别是内脏脂肪过多造成的中心性肥胖，导致胰岛素抵抗，胰岛素抵抗又促使发生高血压、血脂异常(甘油三酯、LDL增高和HDL降低)，当胰岛β细胞发生缺陷时，导致糖尿病发生和发展。胰岛素抵抗时血浆纤溶酶原激活物抑制剂(PA1)增加，增加后血栓性疾病发生。本实验选用特殊高脂饲料(脂肪热比占59%)造成肥胖大鼠，其ISI明显下降，糖脂代谢紊乱，脂肪代谢产物FFA明显增加，大网膜脂肪组织中PAI1mRNA表达增加，造成具有典型特征的IR大鼠，可以用于IR研究药物干预要求。
　　产生IR是多因素多环节的，机制十分复杂，中医药辨证施治及药物的复合治疗作用无疑对功能失调的IR具有极大的优势。近年来中医界多数认为中心性肥胖是IRS征候群的中心环节，病因与过食肥甘密切相关，可损伤肝脾形成痰郁、痰湿、痰浊等，湿热内生，进一步导致气血运行缓慢，脉络淤滞，故其发展演变，由早期的超重、肥胖，继而出现高血压、高血脂、糖尿病等疾病，进而又会出现诸多并发症，如冠心病、中风、视网膜病变等，而胰岛素抵抗贯穿于始终，是重要的诱发因素。从中医学病机上，则可用“郁、热、虚、损”来概括这一演变规律[5]。
　　现代医学对于肥胖与IR严重相关已无可质疑，内脏脂肪组织甚至于被命名为新的内分泌器[6]，在IR发生发展过程中作用巨大，脂肪组织可分泌多种代谢产物和脂肪细胞因子，PAT1就是其中之一。PAI1是纤溶系统的主要调节因子，IR与PAII增高密切相关[6]，它既存在于胰岛素抵抗综合征形成过程中，又是连接IR与心血管疾病的桥梁，高PAI1独立成为心血管事件的危险因子，与其他因素相互作用加重对心肌的危险性。中医认为在IR早期，以痰湿郁热内生为主，而黄连素主要来源于传统清热燥湿之中草药黄连，其对IR动物内脏脂肪组织PAI1mRNA表达的早期干预作用恰合中医理论，因为胰岛素抵抗引起的PAI1水平升高，可发生纤溶障碍，增加血栓形成风险，即中医所讲的痰湿血淤，这一点和中医对该病的病变过程认识一致。故对内脏肥胖型有良好的预防及治疗作用。本课题选用大网膜脂肪组织通过分子生物学技术测定PAI1mRNA的表达，可以较灵敏地反映药物早期干预该基因表达的影响，实验表明与模型组相比大鼠大网膜脂肪组织的PAI1表达减少，从而可能促进纤维降解，有利于日后防止血栓形成。
　　胰岛素抵抗会引起血脂紊乱，包括甘油三酯升高、LDLC增加和HDLC降低。本实验研究表明黄连素和牛磺酸均可以改善这些传统的心血管危险因子，升高HDLC，从而改善IR。以往研究表明黄连素防治IR的主要机制包括受体后效应，可通过抑制糖异生和促进糖酵解产生降血糖作用，降低高胰岛素血症，增加胰岛素的生物活性，促进脂类分解代谢，提高机体抗氧化能力;促进胰岛β再生及功能恢复;有与二甲双胍相似的增加胰岛素敏感性作用[7]。中医认为正气不足也贯穿于IR过程中，实验中牛磺酸作为条件性必需营养素是分布广泛、效应多样且毒性较小的自调素，已被证实具有明确的改善糖脂代谢的作用，牛磺酸改善IR的作用可能与其具有胰岛素样生物效应有关[8]，与黄连素合用可以起到扶正祛邪的复合作用，二者协同作用明显优于单独作用。是否日后可开发一种具有集预防保健与治疗一体的合成制剂，有待进一步研究。
　　黄连素和牛磺酸分别具有明确的改善IR作用，增强胰岛素敏感性，调节糖脂代谢，并可能通过影响脂肪组织细胞因子PAI1mRNA的表达而发挥早期阻断心血管疾病的作用。二者协同作用明显优于单独作用。但由于这些仅仅是部分替代指标，而非终点事件，因此，是否确实能为伴有IR的各类患者提供心血管保护还有待于日后进一步研究。
　　【参考文献】
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