烫伤大鼠中枢氨基酸递质和心血管功能改变的关系

　　关键字： 心血管功能
　　烧伤早期(休克期)的机制复杂，影响心血管功能衰竭的外周因素，如血流动力学、内毒素、细胞因子等已有报道[1～3]，而中枢机制是其改变的重要调控环节。中枢氨基酸递质是对心血管活动起重要调节作用的神经递质[4，5]，下丘脑是调节心血管活动的主要皮质下中枢，氨基酸递质丰富。本研究拟观察烫伤大鼠早期下丘脑氨基酸递质的变化，以及它们对大鼠心血管指标的影响，为烧伤休克的机制研究提供新的实验资料。
　　1　材料和方法
　　1.1　主要试剂和药品　γ-氨基酸(GABA)，印防己毒素(PT)均为Sigma公司产品;3H-GABA由上海原子核研究所提供，比活性：35.12Bq/mg;海人酸(KA)由南京大学生化系提供。
　　1.2　动物分组及烧伤模型制备　SD大鼠(分别由南京大学实验动物中心和长海医院实验动物中心提供)，雄性，体质量200～250g，烫伤后随机分为3组：下丘脑氨基酸递质测定组、下丘脑GABA受体测定组和侧脑室给药组，3组均设相应平行对照组。药物为GABA受体拮抗剂PT和谷氨酸受体激动剂KA，注入量均为10μl，浓度均为0.1mmol/L。大鼠俯卧于鼠板上，背部剃毛，100℃水烫20s，形成30% TBSA Ⅲ度烫伤模型。
　　1.3　下丘脑氨基酸递质测定　参照南京大学生化系脑组织氨基酸相对含量测定方法。步骤如下：大鼠断头后立即投入液氮中冷冻，30min后取下丘脑，称量后放入装有预冷的75%乙醇匀浆器中2000r/min匀浆30s，倒入蛇型回流冷凝器，90℃水浴加热10min，置离心管内4000r/min离心20min，上清液在90℃水浴中加热蒸发乙醇，冷却后倒入球型分液漏斗，加无水乙醚10ml，振荡后静置10min，下层水相液体放入三角烧杯，40℃水浴蒸发乙醚，并用干燥箱在60℃抽干备用。测定时将标本用1.0mol/L HCl和0.1mol/L NaOH定容，充分搅伴后取10μl，置氨基酸自动化分析仪中分析氨基酸色谱。分析柱：4mm×150mm，树脂：2619型;脱氨柱：4mm×50mm，树脂：2950型;柱温：53℃，洗脱液泵1∶0.225ml/min，茚三酮泵2∶0.3ml/min。分析程序为12min标准蛋白质水解液程序。根据氨基酸峰面积计算氨基酸相对含量。
　　1.4　下丘脑GABA受体测定　采用神经元突触膜放射配基结合测定法检测下丘脑GABA受体的大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)值。
　　1.4.1　突触膜制备　剪头，取下丘脑置于冷生理盐水中，按脑∶蔗糖为1∶4比例加入0.32mol/L蔗糖(去蛋白)，标本匀浆管置于冰水中电动匀浆(8档，上下7～8次，约2min)，匀浆液分装，以0.32mol/L蔗糖配平质量，放入低温离心机，以1500r/min离心10min，取上清液(内含膜)，分装配平，放入低温离心机，以1×104r/min离心20min，去上清液，留沉淀物(内含膜)，沉淀物中加入10mmol/L Tris-HAc溶液1ml，放入低温离心机，以1×104r/min离心20min，去上清液，再留沉淀物，再加入10mmol/L Tris-HAc溶液配平质量，1×104r/min离心20min，去上清液，留沉淀物加适量Tris-HAc溶液冷冻保存。
　　1.4.2　加样　设双复管，每管内加入不同浓度的放射配基(3H-GABA)和定量膜蛋白(约100μg)，平行的非特异管再加入抑制剂(非标记的GABA)，用Tris-HAc缓冲液补足至总反应体积为500μl，25℃孵育振荡60min，以预冷的Tris-HAc缓冲液(pH7.4)终止反应，立即用49型玻璃纤维滤纸抽滤，用预冷的Tris-HAc溶液洗涤、抽滤，取下滤膜置于闪烁瓶内，烘箱内烘干待测。
　　1.4.3　检测　闪烁瓶中加5ml闪烁液，用美国Beckman LS-9800型液体闪烁仪计数。蛋白质量浓度用考马斯亮蓝法测定，按Scatchard作图法，计算出大结合容量Bmax和平衡解离常数Kd值。
　　1.5　大鼠侧脑室给药方法　根据Pellegrino图谱的定位方法，将大鼠固定在立体定向仪上，按侧脑室位置在颅骨上钻孔(以颅骨矢状缝、冠状缝交点为原点，孔中心位于原点向左旁开1.6mm处，前后不移动)，将侧脑室套管垂直埋入并固定，用10μl微量注射器将药物注入，实验结束后作脑切片证实套管位置是否正确。
　　1.6　记录心血管指标　导管分别插入股动脉和经颈总动脉插入左心室，与压力-电压换能器相连，由四导生理仪放大后记录平均动脉压(MAP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室内压大变化速度(±dp/dtmax)。各项指标以烫前水平为，观察烫伤大鼠注射药物后2h各指标的相对变化。
　　1.7　统计学处理　实验数据以±s表示，采用t检验。
　　2　结　果
　　2.1　烫伤大鼠侧脑室注入PT和KA对心血管指标的影响　烫伤大鼠侧脑室注入PT可较显著地阻挡其心血管指标的下降趋势，注入KA对心血管指标也有一定的影响。
　　2.2　烫伤大鼠下丘脑氨基酸递质含量的改变　与对照组相比，GABA含量在伤后1h已有升高，伤后2 h则明显升高(P<0.05);谷氨酸含量在烫伤后1，2h有所降低;其他氨基酸递质含量无明显改变(表2)。
　　2.3　烫伤大鼠下丘脑GABA受体的改变　与对照组相比，烫伤组高亲和力GABA受体和低亲和力GABA受体的Bmax均明显增加(P<0.05)，但Kd值无明显改变。
　　3　讨　论
　　烧伤休克是一类影响因素较为复杂的循环休克，其心血管功能状态对它的转归有直接影响。现已证明中枢GABA对心血管活动有抑制作用，谷氨酸有兴奋作用。本实验室还观察到下丘脑室旁核的GABA递质对烫伤大鼠血压有明显影响[6]。本研究在此基础上较深入地探讨了中枢GABA、谷氨酸等氨基酸递质对大鼠烫伤早期的心血管功能的影响。结果表明，烫伤早期大鼠下丘脑GABA含量明显增加，谷氨酸含量有所降低，其他氨基酸递质含量无明显变化，GABA受体Bmax也明显增加;进一步在侧脑室注入PT和KA拮抗GABA和激活谷氨酸作用，发现可以明显阻止大鼠的心血管功能指标下降趋势。以上结果说明烫伤大鼠早期心血管功能减退，不仅和外周因素有关，而且可能和下丘脑调控心血管活动的GABA及谷氨酸递质变化有关。
　　烫伤大鼠早期下丘脑氨基酸递质的调控变化机制尚不清楚。我们推测可能由于烫伤早期机体应激代偿反应引起中枢各递质系统的激活或抑制，而递质系统之间的相互影响、作用，改变它们彼此的分泌、释放和代谢。
　　以上分析提示，大鼠烫伤早期中枢GABA及谷氨酸递质改变可能是其心血管功能减退的影响因素之一，至于它和外周影响因素之间的相互关系，还需进一步研究。