分泌性白细胞蛋白酶抑制因子在创伤愈合中的潜在应用前景

作者：屈纪富，江德鹏
　　【摘要】 分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)是一种可以对抗各种丝氨酸蛋白酶活性的12kDa阳离子蛋白，其羧基末端具有抑制糜蛋白酶、胰弹性蛋白酶等方面的活性，氨基末端有抗细菌、抗真菌、抗逆转录病毒等多方面的活性。近来研究发现，SLPI可通过生长增殖、细胞凋亡、组织改建等多种途径来调控创伤微环境，从而影响创伤愈合进程。本文就SLPI参与创伤愈合过程的可能环节和作用综述如下。
　　【关键词】 分泌性白细胞蛋白酶抑制因子;创伤愈合;增殖

　　Abstract: Secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI)is a 12kDa mucosal secretory protein that is identified as a potent inhibitor of various serine proteases.The active inhibitory sites for leukocyte proteases and elastase are located in Cterminal domain,whereas,the activities of antibacterial,antifungal and antiretrovirus are found in Nterminal domain.Recent studies suggest that SLPI modulates wound healing via the activities of proliferation,apoptosis,tissue remodelling.This review focuses on the possible approaches and functions of SLPI in the process of wound healing.

　　Key words:secretory leukocyte protease inhibitor;wound healing;proliferation

　　1 分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)的基本特性
　　SLPI是一个12kDa大小的阳离子蛋白，属于内源性免疫相关蛋白，在酸性环境中稳定。SLPI是包含107个氨基酸的单链多肽[1]，其羧基端结构域(也称酸性蛋白域)含有Trappin家族所共有的蛋白酶结合区，氨基端结构域介导与肝素的结合，形成可逆复合体后发挥其抗微生物活性。人SLPI基因定位在染色体20q 1213.2，长约26kb，包括4个外显子(exon)和3个内含子(intron)[1]。
　　SLPI是一种由黏膜被覆上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等分泌的非糖基化蛋白，存在于各种黏膜分泌液中，包括唾液，呼吸道分泌液，胃肠道分泌液及子宫颈黏液等，在黏液中其生理浓度大约是0.1～10μg/ml[2]。创伤后SLPI表达显著增加，Urso等[3]通过定量RTPCR和Western blotting方法发现，脊髓损伤后SLPI基因和蛋白表达均显著增加;皮肤角化细胞也可表达SLPI，并且其创伤后表达远较中性粒细胞量更高。我们前期研究发现[4]，大鼠伤口局部组织SLPI表达显著增加，伤口液刺激可使大鼠皮肤来源的真皮多能干细胞表达SLPI显著增加，提示SLPI在创伤愈合中有重要意义。鉴于SLPI具有较强的抑制血浆蛋白酶、抗细菌、抗真菌、抗病毒活性，还能够调控生长增殖，在创伤过程中呈高表达，而SLPI基因缺失的动物伤口愈合明显延迟，炎症反应加剧，蛋白酶活性增强，基质沉积延迟[5]，提示SLPI可通过多种途径来调控创伤微环境，从而影响创伤愈合进程。
　　2 SLPI的抗蛋白酶和抗炎活性
　　SLPI主要的作用是保护局部组织免受过度炎性反应的影响。SLPI通过抑制蛋白酶的活性来保护局部组织，包括中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶和胰蛋白酶，胰腺细胞分泌的糜蛋白酶和胰蛋白酶，肥大细胞分泌的胃促胰酶等[8]。弹性蛋白酶的过度释放是导致急、慢性肺部疾病的主要因素之一，慢性支气管炎发作时，上呼吸道分泌液的SLPI浓度显著增高，以通过抗蛋白酶作用来达到抗炎作用，以免机体发生过度炎性反应[7]。Barrios等[6]采用气道高反应性体内、体外模型进行研究，结果显示SLPI可以显著抑制胰蛋白酶介导的平滑肌高反应。内源性SLPI对其他肺部炎性疾患如肺气肿、囊性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征等均有保护和治疗作用。SLPI的抗蛋白酶活性主要在羧基末端，氨基末端没有抗蛋白酶活性，但能够稳定蛋白酶-抗蛋白酶复合物。SLPI还能够增加谷胱甘肽的水平，降低前列腺素E2和基质金属蛋白酶的合成，减少组织的氧化损伤[7]。
　　除通过抑制蛋白酶途径，SLPI也可以通过下调巨噬细胞对LPS的反应来保护局部组织对抗炎性产物，脂多糖(LPS)直接或者通过肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)1β、IL6、IL10诱导巨噬细胞释放SLPI[8]。但SLPI反而通过保护IκB核因子κB(NFκB的抑制因子)来抑制NFκB的作用来调节炎性反应，使巨噬细胞不能释放促炎因子和一氧化氮(NO)[8]。
　　创伤愈合过程中机体同样会出现炎症反应，创伤局部过度炎症反应是影响部分创伤，特别是慢性创面愈合的重要因素，而SLPI具有抗炎和抗蛋白酶活性，因此，对创伤愈合具有重要意义[5]。
　　3 SLPI的抗细菌和抗真菌活力

　　为了检测绝经前后妇女子宫内膜分泌液中抗菌因子的活性，有作者[9]观察发现绝经前妇女增殖期和分泌期子宫内膜分泌液可以杀死金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，而绝经后子宫内膜分泌液无抗菌活性，进一步研究发现绝经前子宫内膜分泌液中SLPI的浓度显著高于绝经后，而给予SLPI抗体能够显著降低绝经前子宫内膜分泌液的抗菌活性。体外研究结果表明[10]，子宫内膜上皮细胞株HEC1A不分泌SLPI，无抗菌活性，而HEC1B可以分泌SLPI和另一个抑制细菌生长的因子，则具有抗菌活性，提示SLPI有广谱的抗细菌活性。氨基末端是SLPI抗菌的活性区域，SLPI的抗菌活性包括SLPI结合到细菌的mRNA和DNA上，并与SLPI的氨基末端构象的改变有关。
　　另外，SLPI还具有较广谱的抗真菌活性，能够对抗烟曲菌和白色假丝酵母菌。重组SLPI能部分抑制真菌蛋白酶活性，并在体外气道上皮细胞中抑制继发的炎性反应。SLPI上调可以对抗真菌感染，但正常情况下，SLPI的分泌量有限，当口腔防线被突破时，真菌感染随之而来，所以唾液中SLPI上升可以提示口腔真菌感染[11]，有研究提示在人免疫缺陷病毒感染的患者中，唾液中SLPI浓度升高(>2.1ug/ml)对口腔念珠菌感染有预警作用。另外，唾液SLPI的浓度随年龄上升而减少，因此，老年人口腔真菌感染的风险相对较高。
　　4 SLPI的调控生长增殖作用
　　很多研究结果[12,13]均提示SLPI在调控生长增殖方面具有明确的作用。多种肿瘤细胞，如上皮癌细胞，人子宫内膜，卵巢，呼吸道和神经组织的肿瘤和肉瘤细胞中均发现SLPI的高表达;SLPI也能够在体外支持无血清环境中造血干细胞的生长，加入SLPI中和抗体后这种效应消失;SLPI和子宫血浆纤维溶酶/胰岛素抑制因子(uterine plasmin/trypsin inhibitor，UPTI) 能够促进猪腺上皮细胞生长增殖，而且两者有协同作用，这种作用可以被肝磷脂(能增强SLPI的抗蛋白酶活性)增强，而使用SLPI抗体后，SLPI的促增殖效应消失。Lai等[12]研究发现SLPI能促进角化细胞的生长增殖，其表达同角化细胞生长的速率正相关，表皮生长因子能够促进SLPI的表达。另外，Devoogdt等[13]发现在增殖较快的3LLSsc细胞中SLPI表达升高，将SLPI转染入增殖较慢的3LLS细胞中，能够明显加速细胞的生长增殖。这些研究结果提示，SLPI可能同生长增殖相关。
　　SLPI具有明确的促生长增殖作用，但其作用机制仍未完全阐明。有作者[14]推测其可能与SLPI的抗蛋白酶活性有关，但更多研究[15]提示SLPI调控生长增殖可能同抗蛋白酶活性无关。SLPI能够促进cyclinD1的表达，细胞表达SLPI水平同转化生长因子(TGF1)，胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)的表达呈负相关。我们前期研究发现，SLPI对真皮多能干细胞有同样具有促增殖作用，并呈剂量依赖关系;通过氚标记胸腺嘧啶核苷([H3]Thymidine)掺入实验发现，加入SLPI后，真皮多能干细胞有丝分裂明显增强;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)结果显示，在SLPI诱导下，真皮多能干细胞细胞周期素依赖性激酶(cdk2)表达增强，而cyclinA和cdk4表达没有明显变化，Western免疫印迹结果发现，SLPI因子刺激后cyclinD1、cyclinE表达均明显增强[16]，提示SLPI促进真皮多能干细胞增殖的机制可能是通过调节cyclinD1，cyclinE，cdk2等细胞周期素的表达来实现的。也有研究表明[17]SLPI调控生长增殖可能同MARK信号通路有关。当然，SLPI调控生长增殖的途径和信号通路极为复杂，在不同生理和病理状态下也不完全相同，其分子机制仍有待于进一步研究。
　　5 SLPI参与创伤愈合的其他作用
　　SLPI除参与细胞增殖调控外，与细胞凋亡也相关。Simpkins等[18]研究发现，SLPI过表达可形成一种促进细胞存活的环境，使细胞凋亡减少，而给予SLPI中和抗体和SLPI miRNA则可以诱使细胞凋亡增加，提示SLPI可能通过增殖、凋亡等与细胞生长密切相关的环节促进创伤修复过程。另外，SLPI也参与了创伤修复过程中的组织改建和细胞外基质沉积等过程。Angelov等[19]研究发现，SLPI基因缺失的动物创伤后细胞外基质沉积明显减少，与其降解相关的基质金属蛋白酶(MMP)表达则明显增强，体外实验同样证实了SLPI可以减少胶原等细胞外基质含量的表达。SLPI也可通过抑制胶原收缩作用来参与创伤后的无瘢痕愈合。因为胶原过度收缩是创伤后瘢痕形成的重要因素，SLPI基因转染则可以抑制胶原的收缩，而给予SLPI的中和抗体则可以消除其作用;因此，SLPI不仅参与创伤修复过程，而且也与瘢痕形成密切相关。
　　6 小结

　　创伤愈合是一个涉及多种细胞因子、组织修复细胞和细胞外基质的复杂活动，包括炎症反应、组织细胞增殖(肉芽组织形成)、组织改建等过程。SLPI具有抑制蛋白酶、抗炎、抗细菌、抗真菌、调控生长增殖及组织改建等多方面的活性，它在炎症感染控制、细胞生长增殖等与组织修复和创伤愈合密切相关的领域有广阔的研究和应用前景，但其作用环节及相关分子机制仍有待于深入研究。
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