串联质谱技术在药物代谢研究中的应用

         药物代谢是指药物在体内或体外发生的生物转化过程。其生物转化过程包括药物分子功能团的增减、变 换、分子的缩合、降解等。药物经生物转化后,其相应的理化性质亦发生变化,从而引起其药理及毒理活性的 改变。药物代谢的研究,包括药物及其在体内或体外基质中代谢物的分离、结构鉴定以及痕量分析测定。利用 MS/MS和LC-MS/MS等联用技术,不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化代谢物样品的工作,而且能分离 鉴定以往难于辨识的痕量药物代谢物,从而迅速、方便地解决问题。因此,在探讨药物代谢特征、确定药物代 谢物结构及代谢途径与药物及代谢物的药理作用及间的关系,即结构-代谢-活性/毒性三者之间的相关 性等药物代谢研究方面,色谱质谱联用技术已经成为应用非常广泛的分析平台。          
         一、高分辨质谱在药物代谢物研究中的应用
在药物发现和发展的多个阶段,尽可能快的发现、鉴定和确证代谢物至关重要。仪器的发展能够产生信 息非常丰富的原始数据。例如,诸如飞行时间质谱(TOF)等精确质量数仪器有能力在单次分析中同时提供 定性和定量的信息。然而,如果手动处理数据,尤其是当模拟信号数据和一级、二级数据一起采集时,数据 分析就变得相当复杂并且要耗费大量时间。这就需要软件能够对精确质量数据进行自动的代谢物发现、鉴定 和确证。在本章中,我们将展示AB SCIEX的me[x]tabolitePilotTM软件和TripleTOF®系统如何能让代谢物的鉴定 和确证过程比以往更简便、有效。 
         应用实例I:应用TripleTOF®系统和me[x]tabolitePilotTM软件解决代谢物鉴定过程中的瓶颈问题 
         高分辨精确质量LC/MS/MS已经成为代谢物鉴定的一项重要技术。在药物发现阶段,高扫描速度的MS和 MS/MS,以及强大的全扫描能力非常适用于候选化合物优化阶段主要代谢物的鉴定。在药物发展阶段,强大 的功能如实时多重质量亏损(MMDF)触发IDA和高质量准确度的MS/MS使得即使在如胆汁等的复杂基质中, 也能表征体内代谢物,并同时进行深入的结构阐明。 随着高分辨仪器功能越来越强大,手工处理和解释大量的数据成为主要的挑战。为了体现高分辨数据带来 的诸多益处,有必要采用集成的软件用于检测代谢物,执行MS/MS解释和结构阐明,以及比较不同样品间代 谢物的差异等研究。AB SCIEX TripleTOF® 系统结合me[x]tabolitePilotTM 软件提供了一个直观、完整的硬件和软 件整体解决方案,展示了速度、灵敏度以及易用性方面的强大优势。 先进的技术,真正实现了在不损失任何性能条件下,同时定量/定性分析 AB SCIEX TripleTOF® 系统在一台仪器上结合了三重四极杆和精确质量分析器的好特性。使其具有三 重四极杆的宽线性范围和高灵敏度的性能用于定量分析,结合精确质量质谱仪的高扫描速度、高质量准确度 (1-2 ppm 或更小)和高分辨率用于定性分析。从而可在IDA模式下,匹配UHPLC进行快速分离的同时也能获 得信息丰富的高分辨率TOF MS和MS/MS数据。所有数据均在不牺牲速度、灵敏度和质量准确度以及线性的条 件下获得的。
         图1展示了丙咪嗪I相代谢物的色谱图。 

         图1. 全面覆盖I相代谢物。 丙咪嗪孵化5分钟后,叠加在一起的精确质量提取离子流色谱图XIC's。 应用通用的TOF MS IDA方法,2.5分钟完成丙咪嗪I相代谢物的全面鉴定,同时每个色谱峰均保证 有足够的数据点用于定量。 
         实时多重质量亏损触发IDA (MMDF-IDA)
         质量亏损过滤是一个功能强大的精确质量技术,用于检测与母药相关分子组成的I相和II相代谢物。尤其 是在复杂的体内样品中更有利。传统的方法是对采集后数据进行质量亏损过滤用于鉴定潜在的代谢物峰。然后 再重新进样获得这些峰的MS/MS质谱图。由于这个方法要求进样两次,且有两个数据处理阶段,非常耗时。 TripleTOF®系统改变了这个工作流程,把质量亏损作为IDA标准运用到数据的实时采集中,一次进样同时 触发MS/MS。多重质量亏损范围可在IDA标准中指定(图2)。由于TripleTOF®系统快的采集速度,可以在每 次采集完TOF MS后执行质量亏损过滤,满足与设定标准匹配的离子优先被选择触发MS/MS扫描。 

         图2. 实时多重质量亏损触发IDA。质量亏损范围可在Analyst®软件方法设定界面编辑 设置,作为IDA标准,用于选择实时触发MS/MS。 实时多重质量亏损触发IDA,保证即便是体内复杂基质样品和一些低浓度的代谢物(表1),也能一次进 样同时获得高分辨的MS和MS/MS数据。这不仅仅提高通量,而且使得数据分析和浏览更加快速、简便。 

         表 1. 应用MMDF- IDA鉴定胆汁中双氯酚酸代谢。 
         一次进样成功采集到所有代谢物MS/MS质谱图1
         集成MS/MS碎片归属功能
         在代谢物鉴定数据解释中,MS/MS碎片解释和代谢物的结构阐明无疑是费力和耗时的一项任务。通 常情况下,这些工作需要由不同的软件来完成,并且常无法将存储、结果报告、结构推测以及支持结构推测的 MS/MS碎片解析等功能整合在一起,给科研工作者带来很大不便。me[x]tabolitePilotTM 软件有强大的MS/MS碎 片解析功能,并直接将该功能整合在结果界面中。浏览潜在的代谢物时,科研工作者能编辑结构,并自动进行 碎片归属(图3)。结构和碎片解释保存在结果表中,数据浏览时可直接调用,同时软件能自动产生报告。 被选择的碎片会自动高亮显示在结构上。同样,软件也将自动显示所选碎片可能的中性丢失,并在MS/ MS质谱图上展示与其他子离子的关系。为了便于数据浏览,对每种碎片的归属进行打分。质谱图能自动标注 碎片结构和元素组成(图3)。由于在MS/MS模式下TripleTOF®系统的高分辨和高质量准确度,软件可明确计 算出碎片离子的元素组成。集成的功能使得科研工作者能够在友好的界面下,快速评估不同代谢物的结构。结 构和整个的碎片归属结果都将自动保存在结果界面中(图4)。 

         图 3. 整合的MS/MS分析功能。在结果界面中,可直接对预测的代谢物进行结构编辑和自动的碎片解 析。选择离子的碎片自动分配并在结构上高亮显示出来。 

         图 4. 结果界面。作为结果表中一个组成部分,当选择到某代谢物时,软件会自动显示其结构。
多样品相关性分析 随着MIST指导原则越来越多的强调,多个样本间代谢物的相关性分析和相对量的评估已经成为数据解释 的一个重要组成部分。例如,代谢轮廓分析需要比较不同物种之间代谢物,并尽可能早的发现高比例的代谢 物。体外 - 体内相关性以及不同时间点代谢物动力学的研究也要求多样本相关性分析。在传统的软件中,因为 一次只能处理一个样品/对照,需要把数据输出后再进行进一步的相关性分析。me[x]tabolitePilotTM软件能非常轻 松地执行多样本之间代谢物相关性分析,在一个界面中,自动产生多个样品代谢物的趋势图,叠加的色谱图, MS和MS/MS质谱图。 图5展示了对丙咪嗪微粒体孵育样品不同时间点的相关性分析。在批处理模式下自动处理所有时间点的数 据,产生结果列表,然后选择所有的结果进行相关性分析。软件自动生成列表,并显示出所有样品中每个代 谢物的峰面积,图上显示所有样品中丙咪嗪二氧化代谢物的叠加色谱图、MS和MS/MS质谱图。软件能够对 MS和UV数据,以及其它类型的模拟信号数据等进行分析。软件还能基于UV的信号来校正不同代谢物的MS响 应,并能将相对校正因子逐一应用到每个代谢物上。 在软件中可以选择一个或多个代谢物,产生其峰面积的轮廓图。用户还能够在折线图和柱状图之间轻松切 换(图6),在比较不同种属之间的代谢物时,这将是非常有用的功能。同时,软件也能产生代谢物的峰面积 自动汇总表,汇总表中显示所有样品中每个代谢物存在与否。此外,软件能自动产生相关性分析报告,其中所 有的图表能非常容易的从相关界面中复制粘贴。 

         图5. 相关性分析界面。me[x]tabolitePilotTM软件用于多样本之间相关性分析以及不同时间点代谢物的比 较。除了自动绘制选择的代谢物轮廓图外,色谱图和MS/MS数据也会叠加显示。

图6. 灵活的数据图表。用户能对所选代谢物在折线图和柱状图之间快速切换,用于不同时间点代谢 物研究和种属之间代谢物的比较。 
         结论
         TripleTOF®系统和me[x]tabolitePilotTM软件显著改善了从复杂样品的分析到结构阐明等代谢物鉴定的瓶颈 问题。
实时多重质量亏损触发IDA是一个功能强大的采集方法,即便是复杂基质样品以及低浓度的代谢物, 一次进样就可完成MS/MS的数据采集。 
         集成MS/MS碎片解析功能,提高了比较耗时的代谢物数据分析的效率,在一个界面内即可完成推测代 谢物结构的碎片解析。 
         在同一个结果界面中自动进行UV,MS和MS/MS数据的相关性分析,并能够快速、简便的进行数据浏 览。 
         多样本之间相关性分析,非常容易地进行多样本之间代谢物的比较,超越了传统的单个样品/对照处 理,不需要在另外的软件中手动处理。
参考文献 1. Jie Xing, Kerong Zhang, Minghshe Zhu, et al, WOG PM 2:30, The 59th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 5 – 9, 2011, Denver, CO.
2. Rapid me[x]tabolite Identification using me[x]tabolitePilotTM Software, AB SCIEX Technical Note, Publication 2490211-02.
3. “Simultaneous Pharmacokinetic Profiling and Automatedme[x]tabolite Identification using the AB SCIEX TripleTOFTM5600 System and me[x]tabolitePilotTM Software”, AB SCIEX Technical Note, Publication 1270210-01.
4. “Solving Bottlenecks in me[x]tabolite ID Data Analysis With me[x]tabolitePilotTM Software”, AB SCIEX Technical Note, Publication 3610211-01.
5. “Breakthrough Productivity for ADME Studies Using the AB SCIEX TripleTOFTM 5600 System”, AB SCIEX Technical Note, Publication 0480110-01.
6. “Evaluation of Chemically Intelligent Acquisition and Processing Tools as a Platform for Discovery me[x]tabolite Identification,” R. J. Mortishire-Smith et al, TP 222,The 59th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 5 – 9, 2011, Denver, CO.