小檗碱对肺炎链球菌侵袭A549细胞的保护作用

          摘要 目的：通过体外实验，研究小檗碱是否对肺炎链球葛( Streptococcus pⅡeumorua，S.pn)侵袭人肺Ⅱ 型上皮细胞(A549)有保护性抑制作用。 方法：用不同浓度的小篥碱预处理A549细胞，并与S.pn -起与A549细胞共同作用，通过用0.025%的Triton X-IOO裂解细胞，然后将稀释后的裂解液涂布TSAB平板．培养过夜．计数平板上的茵落数。
          结果：小檗碱的浓度为0，25，50，100，200 pcg/mL时，S.pn对24孔板上每孔 A549细胞的侵袭教分别为52t21，29tll，13tl0，0，0；在其浓度终浓度为100 pLg/mL时，未得到可测的细菌数：结论：小檗碱可抑嗣S.pn侵裳A549细胞，两者问存在剂量依赖关系。 关键词肺炎链球菌；肺Ⅱ型上皮细胞（A549）；侵袭肺炎链球菌(Streptococcus pneumomae，S.pn)为革兰阳性致病菌，易感人群为6岁以下儿童以及65岁以上老人，由于其抵抗力较弱，发病率和病死率均较高[1]。 
          目前的多糖荚膜疫苗免疫效果不 够理想，而且随着抗生素的不断应用，肺炎链球 菌酌耐药现象愈加明显，使临床预防和治疗S.pn感染性疾病变得更加棘手。小檗碱又称为黄连 素，是一种具有悠久药物作用历史的异喹啉类生 物碱，其作为清热解毒药和抗菌药在临床上已使 用多年，表明其抗菌消炎作用明显，杀菌范围较广。 
          有文献报道，它对葡萄球菌属、链球菌属如S.pn、 炭疽芽孢杆菌、痢疾志贺菌均有强的抑制作用[2]。 本文旨在探讨小檗碱是否可抑制肺炎链球菌侵袭A549细胞，以阐明中药小檗碱的临床抗感染 机制。  
          1材料与方法 
          1.1材料S.pn标准菌株SⅢ型购自中国科学院 菌种保藏中心；肺Ⅱ型上皮细胞(A549)购自中科院上海细胞所细胞库；血琼脂平板培养基购自江门市凯林贸易有限公司；RPMI 1640细胞培养基、 小檗碱购自Sigma公司；TSAB血平板的制备由本 实验室自制。 
          1.2方法
          1.2.1 S.pn培养将S.pn接种于血琼脂平板培养基上，37℃温箱，Su/o C02，过夜培养，刮取菌落于预冷的PBS中，洗涤3次，再用不含双抗的RPMI1640细胞培养液悬浮至108 CFU/mL浓度。 
          1.2.2 肺Ⅱ型上皮细胞(A549)细胞培养 将 A549细胞接种于含适量RPMI 1640培养液的培 养瓶或培养板孑L中，用于整个实验； 
          1.2.3 S.pn侵袭A549细胞实验将A549细胞接 种于24孔培养板板孔中，细胞浓度约2×104个／mL，待其呈单层生长(约5×lOs个/mL)后，吸出孔内培养液，用PBS冲洗3次，加入用不含双抗的RPMI 1640培养液悬浮的对数生长中后期S.pn菌 液10 vL，然加入不含双抗的RPMI 1640培养液1mL，轻轻混匀。用水平式离心机1 000 r／min离心10 min，置37℃50-/0 C02孵箱中温育2h，吸出孔内 液体，用无菌PBS轻轻洗3次，加入含1%FCS,10 U/mL青霉素、200 U/mL庆大霉素的RPMI 1640培养液，置37℃50-/0 C02孵箱孵育1h，以充分杀死胞外S.pn，吸出孔内液体，用无菌PBS洗3次，
加入100 yL 0.25%胰酶、400 yL 0.0250-/0 TritonX-100裂解细胞3 min，10倍稀释后吸取100 yL涂 布TSAB平板[3]，置37℃50-/0 C02孵箱培养过夜。 S.pn侵袭人A549细胞内的个数=平板上计数的菌落数／每培养孔的细胞数。 
          1.2.4小檗碱对S.pn侵袭A549细胞的作用 方 法与1.2.3所述相同，只是在加入S.pn前，用不同 浓度的小檗碱预处理A549细胞2h，然后再加入S.pn继续温育2h。 
         

           1.3统计学处理结果用x+s表示，两组间比较采用方差分析。 
          2结果
          用小檗碱预处理A549细胞前后的侵袭情况：小檗碱可明显减低肺炎链球菌对A549细胞的侵
袭，而且其浓度增加为100 pcg/mL时，未得到可测 的侵袭数（表1，图1）。 表1小檗碱预处理A549细胞前后S.pn的侵袭情况 
          3讨论
          S.pn在临床上是引起儿童肺炎和成人社区获 得性感染的常见致病菌，据估计，在全球范围内每 年由肺炎链球菌引起的脑膜炎为32万多例，菌血症为63万多例，中耳炎1 400万多例，肺炎2 000万乡例[4]。 起初，青霉素等p一内酰胺类抗生素是治疗S． pn感染的并且较为有效的药物，但随着抗生素的不断应用，耐药性S.pn的出现不断增加，并成为全球性的抗感染难题[5]。筛选抗菌药物的主要策 略为杀死耐药菌，但随着抗菌药物的广泛使用，很 快又发现细菌对新的抗菌药物又产生耐药性。
          因此，在临床上寻找新的对抗细菌感染的药物已成 为当务之急。 一些中药具有抗菌消炎、清热解毒等作用，其副作用较小、不易出现细菌耐药等特点，并且中药取材地较为广泛、价格便宜，开发前景良好，是新一代对抗细菌感染的临床治疗性药物。小檗碱又 称黄连素，是一种具有悠久药物作用的异喹啉类生物碱，作为清热解毒药和抗菌药在临床上已使 用了多年，其抗菌作用显著，杀菌范围较广，对葡萄球菌属、链球菌属如S.pn、痢疾志贺菌、炭疽芽孢杆菌等均有强的抑制作用。有文献报道表明，小檗碱能干扰细菌糖代谢中间环节丙酮酸的氧化脱 羧过程，因而抑制细菌的生长繁殖；另外，小檗碱 还可与细菌DNA结合，影响DNA的复制，干扰细 菌生长繁殖[z，6]，从而发挥抗菌作用。作者通过体外研究发现，小檗碱可以抑制肺炎链球菌对A549细 胞的侵袭，在浓度为100 yg/mL时，未得到可浏的侵袭数，小檗碱与S.pn侵袭A549细胞间存在剂量 依赖关系，该研究结果可进一步为临床使用小檗碱治疗S.pn感染性疾病提供实验依据。 
          4参考文献 
          [1] Gillespie SH. Aspects of pneumococcal infection including bacterial virulence, host response and vaccination [J].J Med Microbiol, 1989, 28 (4): 237-248.
          [2]方波，周成合，周向东．小檗碱类抗微生物化合物研究进展 [J]．国际药学研究杂志，2010，37(2)：105-109，113.
          [3] Rubens CE, Smith S,Hulse M,et al.Respiratory epithelial cell invasion by group B streptococci [J]. Infect Immun,1999,60(12)：5157-5163． 
          [4] Tyrrell GJ. The changing epidemiology of Streptococcus pneumoniae serotype 19A clonalcomplexes [J]. J Infect Dis, 2011, 203 (10): 1345-1347.
          [5]藜全华，姚开虎，俞桑洁，等，北京儿童医院19F型肺炎链球 菌耐药性分析及分子流行病学研究[J]．中国实用儿科杂
志，2013, 28(3):179-183.
          [6]郝乘仪，李妍，张秀荣．小檗碱药理作用研究进展[J]．吉林 医药学院学报，2008，2(5)：295-297． 
          （收稿：2014-04-22编辑：吴淑金）