人食管癌相关基因4蛋白的亚细胞定位、纯化和抑癌功能研究

　　人食管癌相关基因4(ECRG4)是中国医学科学院肿瘤研究所病因室克隆和鉴定的肿瘤相关新基因.以往的研究表明,ECR>4是食管癌候选抑癌基因,ECRG4基因过表达抑制肿瘤细胞增殖.然而,关于ECRG4蛋白的亚细胞定位和抑制肿瘤细胞增殖功能国内报道尚少.本研究旨在检测ECRG4蛋自的亚细胞定位,探讨纯化的重组ECRG4蛋白的抑癌功能及其成为食管癌生物治疗的候选药物的可能性.
　　材料与方法 　　
　　1.材料:人食管癌细胞株EC9706在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI1640培养基中,370C,5%C02的培养箱中饱和湿度条件下恒温培养.Lipofectamine2000购自Invitrogen公司.
　　2.ECRG4蛋白的亚细胞定位:(1)内源性:将EC9706肿瘤细胞接种到培养皿中,用4%多聚甲醛固定10minx磷酸盐缓冲液(PBS)溶液冲洗3次.用0.2%TritonX-100细胞通透化处理10min.PBS溶液冲洗3次.2%牛血清白蛋白(BSA)封闭30minxPBS溶液冲洗3次.加人抗ECRG4.蛋自抗体,在温箱中放置1hoPBS溶液冲洗3次)加人荧光标记的二抗,室温孵育45min.PBS溶液冲洗3次.加人0.5m留L的4',6一二眯基一2一苯基叫噪(DAPI)溶液染色15minPBS溶液冲洗3次.后加人20闪封片剂封片,-70℃冰箱中备用.(2)外源性:将EC9706肿瘤细胞接种到培养皿中,参照LipofectminTM2000试剂盒的说明分别转染pEGEP-N1-ECRG4及空载质粒.48h后弃去细胞培养基,PBS溶液冲洗3次,取出玻片,用4%的多聚甲醛固定30min.PBS溶液冲洗3次,在玻片上加入甘油缓冲液,盖在载玻片上,封片.激光扫描共聚焦显微镜成像拍照定位.
　　3.分泌蛋白检测:计数培养24h的EC9706/pcDNA3.1和EC9706/pcDNA3.1-ECRG4细胞,分别置于10cm培养皿中,RPMI1640完全培养基培养至80%融合用无血清的RPMI1640培养基冲洗3次,加15ml无血清的RPMI1640培养基,放置于370C,5%COZ的恒温培养箱中继续培养48h吸取培养基,12000g离心10min,吸取上清用0.45p.,m的滤膜过滤,滤过液浓缩Bradford法检测浓缩液蛋自浓度,取等量蛋白进行分析.用组氨酸(His)标记抗体,通过Westernblot检测ECRC4蛋白表达.
　　4.重组ECRG4蛋白的表达纯化:将截短的ECRG4cDNA和pET30a十连接,构建pET30a+-ECRG4表达载体.转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),通过终质量浓度为0.3mmol/L的异丙基书-D一硫代毗喃半乳糖普(IPTG)低温诱导,表达纯化出大量水溶性的重组ECRC4蛋自.
　　5.urub蓝(MTT)测定重组ECRG4蛋白对肿瘤细胞增殖的影响:将1x10"个EC9706细胞接种到96孔培养板中,RPMI1640完全培养基370C,5%C0}培养过夜,用无血清RPMI1640培养基冲洗各培养孔3次,加人含有不同浓度梯度重组ECRG4蛋白的无血清RPMI1640培养基,用相应的稀释液作为对照,37℃、5%G0,继续培养48h,检测前4h更换新鲜培养液,加MTT(5mg)15闪/孔,继续培养4h,弃去上清液,加二甲基亚矾(DMSO)150p,1/孔,震荡混匀10min,在酶标仪上检测570nm处的吸光度(A)值,计算抑制率.
　　6.统计一学方法:应用SPSS13.0统计软件分析,采用zX检验.
　　结果
　　1.ECRG4蛋自的生物信息学分析:利用生物信息学软件Antheprot6.0对ECRG4蛋自进行预测:ECRG4蛋白是由148个氨基酸组成的小分子分泌蛋白,其5'端1一31个氨基酸为信号肤,断裂点位于25}30氨基酸上;ECRG4蛋白的等电点pHi=8.955;ECRG4.蛋白的物理化学特性和二级结构组成都表明其可能具有重要的生物学功能〕ECRG4蛋白具有多个翻译后修饰位点,反映其生物学功能调控的多样性.
　　

　　所有这些信息都提示ECRG4蛋白的生物学功能可能非常重要.
　　2.ECRG4蛋白的亚细胞定位:激光扫描共聚焦显微镜成像表明,内源性和外源性表达的ECRG4蛋白均定位在细胞质.
　　3.ECRC}蛋自早分泌蛋白:收集转染ECRG4基因的EC9706细胞无血清培养液,Westernblot检测到ECRG4蛋白阳性表达(图1),结果表明ECRG4蛋白可能是分泌蛋白.
　　4.重组ECRG4蛋白体外抑制肿瘤细胞增殖:MTT检测结果表明,纯化的重组ECRG4蛋白体外抑制EC9706细胞生长增殖,抑制率随着重组蛋白浓度的增加而升高.对照组中加人PBS溶液不影响EC9706肿瘤细胞增殖;而将重组ECRG4蛋白加入EC9706细胞培养液中,当实验组重组蛋白浓度达到3m岁L时即具有细胞增殖抑制作用,EC9706肿瘤细胞增殖受到抑制.随着重组ECRG4蛋白浓度的增加,肿瘤细胞的增殖抑制作用也升高,呈剂量一效应关系,差异具有统计学意义(P<0.05,图2)}MTT结果表明,重组ECRG4蛋白具有体外抑制肿瘤细胞增殖的生物学功能活性.
　　讨论
　　ECRG4基因是中国医学科学院肿瘤研究所病因室克隆和鉴定的新基因,定位于2q12.2,全长跨度约12500by,含有I个444帅的完整编码框和4个外显子,编码由148个氨基酸组成的多肤,约17x103.序列比对分析表明,ECRG4基因在各物种进化过程中都高度保守,提示ECRG4在真核细胞生物中可能具有重要的功能.ECRG4在人体正常组织中广泛表达,Northernblot分析表明,ECRG4基因在多种人体组织中包括心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰腺等都表达.通过基因表达系列分析(SAGE)分析和逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测,ECRG4基因在成人的正常食管上皮组织中高表达,但是在食管癌组织和细胞株中低表达,提示ECRG4基因表达下调在食管癌的发生发展中起了重要的作用.目前,ECRG4基因的生物学功能还不是很清楚.目前的研究结果表明,ECRG4是食管癌的候选抑癌基因,ECR('}4基因过表达抑制肿瘤细胞增殖.
　　确定基因的蛋白产物在细胞内的定位,对了解新基因的生物学功能是非常重要的.本研究结果表明ECRG4蛋白可能是分泌蛋白,具有重要的生物学功能.研究表明环氧化酶-2(COX-2)在肿瘤的发生发展中扮演了重要的角色L4}1.我们推测,ECRG4蛋白被分泌到细胞外,通过自分泌或旁分泌的形式,与其特异的受体结合,作用于细胞内信号传导机制,阻断异常核因子(NF)-KB通路的激活,下调COX-2的表达,发挥抑癌作用.而ECRG4蛋白的下调和功能缺失,可能导致NF-KB通路过度激活,COX-2异常表达增加,从而促进食管癌的发生发展.
　　生物信息学分析显示,组成ECRG4蛋白的148个氨基酸中,1一31个氨基酸为信号肤,具有极强的疏水性,而ECRG4蛋白的结构域主要集中在其余的氨基酸序列中.截去N端的1一28个氨基酸并不影响ECRG4蛋白的生物学功能,还可以降低疏水性,有利于诱导水溶性ECRG4蛋白的表达纯化我们构建了截短的pET30a'-ECRG4表达载体,截去ECRC4蛋白前端疏水性的28个信号肤氨基酸,并通过优化条件表达纯化出大量可溶性的重组ECRG4蛋白二当重组ECRG4蛋白浓度为3m盯L时,即具有抑制EC9706细胞增殖的作用,随着重组蛋白浓度的增加,细胞增殖抑制作用也增强,呈剂量一效应关系.因此重组ECRG4蛋白可以作为食管癌生物治疗的候选药物,其抗癌作用和机制值得更深人的研究.目前,我们正在深人研究ECRG4蛋白的抑癌功能和作用机制,以期阐明其在食管癌发生发展中的作用.
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