献血者隐匿性乙型肝炎病毒感染研究进展

         乙型肝炎病毒(hepatit“B访rus,HBV)感染是危害人类健康的严重问题之一,全世界约有3亿HBV携带者,其中我国就有1亿多感染者[Ⅱ21。近年来,一种潜伏性HBV感染形式(LatentHBVinfection),即隐匿性HBV感染(occulthepatit“Bvirusinfecti°n,OBI)受到高度关注。⒛08年在意大利Ta°rminta召开的专家会议上,将OBI定义和基本特征描述为肝组织或血清中HBV表面抗原(HBsAg)检测阴性而DNA阳性(HBsAg—/DNA+),通常病毒载量低或不可定量[3]。隐匿性HBV感染不仅存在于一般人群,部分可以通过输血传播HBV15、还可能与重症肝损伤和肝细胞癌有关[6:],是对HBV输血传播控制、疫苗免疫预防和临床感染诊疗等一系列防治策略的新挑战。因此,阐明0BI发生发展的分子机制,对血液安仝筛查、疫苗改进、临床治疗具有重大指导意义。随着病毒核酸检测工作引人我国献血者病毒感染筛查,检出了数量可观的乙型肝炎表面抗原阴性而DNA阳性(HBsAg—/DNA+)的血液,其中除窗口期感染外,大部分被判定为OBI。现结合自身工作.对国内外OBI研究的新进展做一综述。 
        1 隐匿性乙型肝炎病毒感染研究重点与方向

        自2004年起,英国剑桥大学血液系输血医学部AIlain教授开始关注隐匿性HBV感染[9·2],积极倡议并组织oBI国际协作研究「13]。笔者于2005年起作为剑桥大学oBI项目主要研究者,建立了OBI毒株DNA扩增方法[”],协助Allain教授组织开展OBI国际合作研究,于2007年回国后开始我国流行的OBI生物学特性研究li∶。几年来,Allain教授领寻的团队研究分析了欧洲、北美洲、非洲、亚洲等地区献血人群中流行的()BI毒株基因型A1、A2、B、C、D、E(()BIA1、OBIA2、O~BIB、OBIC、OBID、0BIE)的分子生物学特性,揭示了OBI产生的可能机制,完成了阶段目标,主要结果发表在国际专业期刊i12I。然而,这些主要基于OI3I毒株分子生物学特性提出的0BI产生与存在的科学假说,仍需进一步研究证实,特别是针对我国流行的OBI基因型B和C(O-BIB和0BIC)的研究。在承接OBI国际合作研究进展基础上,我国输血医学工作者应针对本地区HBV流衍特点,进一步揭示病毒蛋白氨基酸关键位点突变:与OI3I的相关性,跟踪分析(汜I毒株在我国献血人群体内病毒复制动态、遗传变异和分子免疫特征,阐明OBIB和OBIC在体内发生发展的主要分子机制,为血液筛查与血液安仝控制提供理论与技术支持。 
        2 隐匿性乙型肝炎病毒感染研究现状发达国家和部分发展中国家已将献血者HIV、HCV和HBV病毒核酸检测纳人血液筛查规程,以减少病毒窗「l期感染和OBI在内的隐匿性感染。目前,在我国血液安伞筛查中已开始了病毒核酸筛查试点工作,但尚未全面展开、仅以HPlsAg检测作为HBV筛查的指标难以检出窗冂期和OBI,仍存在较高的HBV感染残余风险?。通常OBI的病毒载量极低,介于10{1U/ml和不可定量之间,中位数值在102IU/ml以下3回顾性调查发现OBI确实可以传播HBV[17]。在被感染的个体免疫功能受抑时,隐匿性的HBV可能再次复制,转化为典型的乙型肝炎。OBI流行于世界各地,流行率差异较大,介于l:672至1:20166,与HBV流行率成正相关。通过对深圳地区165371例HBsAg阴性献血者的调查显示,深圳献血人群OBI流行率为1:7517[15],低于西非加纳(1:67)[14],高于欧洲(1:9819)甚至南非(1:8⒛9)流行率f161:]。鉴于深圳地区HBV流行率(约1%)远低于全国HBV流行率平均水平(7.2%)[z’z4],推测我国人群整体oBI流行率至少在1:7517以上。 
        隐匿性HBV感染还常见于各类HBsAg阴性的肝病及其他疾病患者中,与重症肝损伤和肝细胞癌有关“创。我们新研究发现,HBV感染者可以引起接种过疫苗免疫的配偶产生oBI[23]。我国及其他地区这种高HBV流行率是否与oBI传播HBV有关Ez°],以及OBI长期存在与肝癌发生发展的关系阳l,都需要更深人和细致的研究。Allain教授于⒛03年研究报道了HBsAg-/DNA+献血者传播HBV的风险[27]。自此,我们对欧洲、北美、非洲和亚洲地区流行的oBI分子生物学特性进行系列研究报道[3δ叼4∶,揭示了部分OBI产生的可能机制。其他为数不多的研究,从不同侧面报道了中国大陆[2:3°]、台湾[⒒32]、香港Ⅱ、韩国31∶、西欧:333:J等地区人群的肝细胞瘤、造血干细胞或献血者中OBI流行状况,个别研究进行了oBI毒株s蛋白分子生物学[3°J91和免疫学特性分析[373:]。 
        3 0BI的主要分子生物学特征及形成机制迄今为止,我们对全球主要oBI基因型A1、A2、B、C、D、E毒株的分子生物学特性已初步了解。归纳研究结果与相关报道发现,OBI毒株各基因型与血清H队Ag阳性HBV野毒株比较,具有以下主要分子生物学特征:

        3.1 基因调控序列碱基变异(Mutationsinv⒒alregulat∝ryelcmems)OBI基因型C毒株的启动子、增强子核苷酸调控序列(SP1、sP2、ENH1和ENH2)与野毒株HBV基因型C比较变异非常显著,而OBI基因型B和E的相应调控序列保守。OBI基因型A1、B、C、E的核心蛋白调控序列(主要包括核心蛋白上游调控序列,CURS;基础核心蛋白启动子,BCP)与野毒株比较,存在关键位点变异或突变,包括缺损、插人、置换等,如BCP内的A1762T/G1764A双突变「:1。这些变异或突变被认为会阻碍HBV基因型A1、B、C和E毒株复制或蛋白合成缺损,是导致OBI产生的原因[lⅡⅡdr,而OBI基因型A2和D毒株的这些调控序列变异不明显[1′1:∶。 
        3.2 剪接机制剪接机制可以产生重组或新蛋白(rec。mbinantorneo—protein),作用于转录、逆转录、翻译或基因组及蛋白转运等过程,从而导致基因组或结构蛋白水平下降,形成OBI「39「。preS2鸬mRNA剪接可以产生非功能性的smRNA,进而编码截短的或杂合的HB蛋白,因而使功能性的非剪接pres2/smRNA水平降低,HBsAg的表达水平相应降低。对5′S剪接供体位点碱基突变(Nuclcotidcmutatlo¨attlles5′sp1kcdonorske)的研究发现,prcs2鸬mRNA剪接对于HBsAg表达是必要的。40%左右的OBI基因型A1、B和C毒株,其pres2鸬剪接供体位点或附近核苷酸发生突变,改变剪接供体的结构,影响Pres2/SmRNA剪接,相应的表面蛋白抗原(H队Ag)表达降低或受到阻断[1:’24]。这种导致HBsAg表达水平降低是否与基因型无关[24],还需对OBI其他基因型A2、D和E分析判定。虽然剪接在功能性的非剪接转录产物及HBsAg的表达水平上所起的作用还不十分确切,但它包括在共转录及转录后调节机制中,成为0BI的一个分子生物学特征Lz1]。 
        3.3 表面蛋白抗原氨基酸突变研究早已证实,HBV表面蛋白(Prcs/s)氨基酸突变,特别是主要亲水区(MHR)或“a”区关键氨基酸诸如G145R/A突变等,可以导致HBV逃避免疫或检测。OBI各基因型毒株Pres/s氨基酸序列与野毒株比较均有显著变异[l^·:加]。采用EI'⒙A测定转染细胞上清中HBsAg水平,实验结果表明,oBI毒株HK8663、HK3110和TW6083的S蛋白基因转染细胞表达的HBsAg水平显著低于HBV野毒株,表明SmRNA剪接位点突变影响s蛋白表达[24]。然而,OBI各基因型表面蛋白抗原(HBsAg)变异的意义确有不同。OBI基因型A2和D毒株的表面抗原的MHR或“a”区氨基酸有多个关键氨基酸的频繁发生突变[1620,23],变异率高;B和C型居中,A1和E变异率低[14J。J引。研究认为oBI基因型A2和D毒株S蛋白受到宿主免疫压力发生突变,是OBI生成并以低病毒载量存在而逃避宿主免疫清除的主要原因[!6J盯。在前期工作中,对C121、C124、C137等位置的半胱氨酸(Cystone)突变纠正,通过体外细胞模型重建了HBsAg反应性,证实关键氨基酸突变可以引起HBsAg发生改变,导致HBsAg检测反应性降低,是oBI逃避免疫清除的原因之一[l叨。另外,表面蛋白抗原氨基酸突变导致HBsAg表达量极低或分泌障碍也是oBI形成的原因之一。zO13年Blsw灬和Candotti"]将18例OBI克隆在体外Huh7细胞上进行转染,按照HBsAg的表达量和分泌方式将0BI分成3种模式,Pattem1、2和3。HBsAg存在分泌障碍只残留于细胞内的Pattcm2占6/18,HBsAg在细胞内和细胞外表达量都很低的Pattem3占7/18。通过对OBI克隆进行点突变及修复(ste_dlrected-mutagenesiscorrectedmutatons),证实了M75T、P178R的突变与HBsAg的分泌障碍相关[43]。 
        3.4 核心蛋白氨基酸突变我们在oBI基因型B和C毒株核心蛋白(Pre￡ore/Core)氨基酸序列中发现多个有意义突变E15·24],而0BI基因型A1、A2、D和E毒株则少见。在有关HBVMxA的研究中发现,MxA可以通过与Core蛋白相互作用抑制HBV复制[44],反之Core蛋白某些氨基酸突变又可以抑制MxA基因转录[45]。这些发生在病毒核心蛋白的重要突变,是否在0BI生成中起到重要作用还需进一步探索。 
        3.5 pgRNA或mRNA转运出核障碍pgRNA或mRNA从细胞核到胞浆依赖于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPHD〉、转录后调控元件(PRE)和多嘧啶序列结合蛋白形成的复合体:。PRE区域的突变或部分缺失可能导致RNA贮存于细胞核内,无法翻译。目前已报道的OBI患者中发现的preS2/SmRNA剪接,5′s剪接供体位点相对保守,位于458位。3′S剪接受体位点已发现1305/1308/1361/1385等位点I39邛〗,部分位于PRE区域内,因此可能影响pgRNA或mRNA转运出核,蛋白翻译水平降低或阻断。 
        4 OBI产生与存在的宿主因素有关OBI产生与存在的宿主因素,特别是宿主遗传免疫方面的直接研究数据还十分缺乏。近有研究报道,抗一HBc阳性与阴性oBI感染者对HBV的保护性免疫反应不同,抗一HBc阳性者T细胞特异性反应与HBV感染康复者相似[17]。另一篇研究报道发现,约30%~40%的0BI献血者对HBsAg、HBcAg和HBeAg有免疫反应,其特异性CD4与CD8介导的T细胞分泌干扰素γ(IFNγ)水平也与HBV感染康复者相似[a:l。然而,这些具有高度变异的OBI毒株的存在,是否为机体特异性免疫控制的结果尚有待证实。研究表明,B、Th等细胞参与HBV免疫反应,并受宿主HI'A限制[1:j。h述oBI毒株的核心蛋白或囊膜蛋白的重要突变位点,可能涉及HBV的B、Th和CTI'免疫表位。在HBV感染中,核心蛋白突变不仅与重症肝损伤相关,还与HBV颗粒低水平分泌以及Th和CTI'免疫逃避表位有关:1ρ和J。核心蛋白Core1827、8896与14⒈151构成了CTI'表位簇,其中S21I冫突变报道为CTL免疫逃避突变,与HBV低载量的HBeAg阴性患者相关。s26A、L95I、T142M等CTL表位突变受HI'AA2、HI'A-A11或HI'A-Aw68限制[195⒈52j,可能由免疫压力所致。在对深圳和东南亚献血者OBI基因型B和C毒株的核心蛋白序列分析中,也发现上述表位内的诸多位点变异,但与OB1宿主的遗传免疫的确切关系需进一步研究阐明。HBV表面抗原(HhAg)是囊膜蛋白的组成部分,包括PreS1、Pres2和s蛋白(Pres/S)。Pres/s是HBV诊断和疫苗免疫的重要靶蛋白,包括B、Th和CTI'表位,特别是s蛋白的“a”区诱导中和抗体产生。OBI基因型A2和D毒株表面蛋白抗原氨基酸突变『162°,23]发生在这些免疫表位内,可能是oBI毒株逃避宿主免疫存在的原因。 
        5 OBI研究方向与展望我国是乙型肝炎高发国家,以HBV基因型B和C流行为主,西部少数民族地区存在一定比例的基因型D。广东地区的HBV基因型主要为B和C,其中B型稍多于C型13。然而,我国大陆报道的oBI确认样品数约80份,其中仅约10份进行了全基因组序列分析[I5·28,30]。加之中国香港和台湾以及东南亚地区报道的约140份OBI样品,总计约220份OBI基因型B和C样品,其中经全基因组DNA序列分析的样品不足60份。这些OBI基因型B和C资料,特别是我国大陆的第—手资料还不足以完全揭示OBI基因型B和C的分子生物学特性。从献血者OBI基因型B和C病毒株分子生物学特性和宿主遗传免疫两个方面研究,阐明OBI发生发展的主要分子机制,可为包括疫苗免疫人群在内的⊙BI:和OBIc监测与防控策略提供重要依据,评价我国正在试点开展的献血者病毒核酸筛查(NAT)效果,以及研究和分析OBI与临床重症肝病或肿瘤发生发展的关系和个性治疗方案提供理论指导。