带状疱疹相关性疼痛患者外周血中Th17细胞及转录因子的变化 A

带状疱疹( herpes zoster，HZ)由潜伏在感觉神经元内的 水痘一带状疱疹病毒再激活，临床表现为按单侧神经节段分布的局部皮肤区域出现疱疹或伴疼痛。目前关于带状疱疹相关性疼痛的机制尚不明确。研究表明辅助性T细胞( helper T cells，Th)在相关性疼痛中起着重要的作用[l]。 辅助性T细胞17( helper T17 cells，Th17)细胞是一种新型研究的Th细胞。目前关于Th17细胞及转录因子维甲酸相关孤独受体yt( retinoic acid receptor related orphan receptor， ROR yt)以及信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transc[x]ription 3，STAT3)的研究主要涉及在过敏性疾病、哮喘、心血管疾病，炎性疾病如炎性反应性肠病等[2]。 关于带状疱疹相关性疼痛中Th17细胞及转录因子的研 究较少，本研究旨在探讨Th17细胞及转录因子ROR yt和 STAT3在带状疱疹相关性疼痛中的变化及意义。

1材料与方法

1.1材料
1.1.1 主要试剂：淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；Anti-IL17-PE抗体、Anti-CD4-FITC抗体和 Anti-CD3 -APC抗体（Bioscience公司）；反转录试剂盒(In-vitrogen公司)；PCR引物合成由英俊公司合成。

1.1.2研究对象：此研究经华中科技大学同济医学院伦理委员会批准，并取得所有涉及此项研究患者和正常人的同意。自2014年6月至2015年12月在武汉协和医院皮肤科、疼痛科门诊及病房选择符合带状疱疹相关性疼痛的患者共20例，根据患者皮损出现后疼痛持续时间分为带状疱疹(HZ)性神经痛组10例；带状疱疹后神经痛(post-herpetic neuralgia，PHN)组10例。入选标准：符合HZ及PHN的诊断标准，所有患者选取年龄在50~70岁，疼痛部位位于躯干部。对照组为健康体检者10名，均来自体检中心。3组均无免疫系统疾病、严重的中枢系统并发症、感染性疾病疾患者、过敏性疾病及心血管疾病者。

1.2方法
1.2.1 标本采集：于清晨采集空腹EDTA抗凝外周静脉血5mL。

1.2.2密度梯度离心法分离血液单个核细胞( PBMC)：将采集的EDTA外周静脉抗凝血离心去上层血清后，使用PBS稀释并转移到含淋巴细胞分离液上，按照密度梯度离心法获得PBMC。

1.2.3流式细胞术检测Th17细胞比例：调整细胞浓度并取1×l06个/mL，离心并重悬于100μL的PBS中，加入5LLL对应的CD3 -APC和CD4 -FITC抗体，常温避光孵育30min，PBS洗涤2次。固定，离心，弃上清液后，加入100μL破膜剂重悬细胞。加入5μL的IL-17A-PE抗体，常温 避光孵育30 min，加入2 mL破膜剂，1200 r/min离心洗涤2次，弃上清液，细胞重悬于PBS（含1% BSA），行流式细胞仪检测。流式细胞仪调节FSC、ssc及电压，根据抗体所标荧光素调节荧光补偿并进行设置门。使用CELLQuest软件进行检测和分析流式细胞术检测各组PBMC中Th17细胞的百分比。

1.2.4RT-qPCR检测PBMC中Th17细胞的转录因子STAT3以及RORyt的基因mRNA的表达：PBMC总RNA提取后，按反转录试剂盒说明书，反转录成cDNA，于- 20℃保存备用或行PCR。本实验反应条件为95℃10min变性，95℃10 s、60℃20 s以及72℃20s共40个循环，与内参基因3-actin和对照组比较得出扩增倍数，采用2- AACt法进行分析。ROR一yt引物序列：正义序列：5，_CCTTTACCTGGGGT CTAACCAA-3’，反义序列：5’-GTGCCACCCCCTAAACTCT-3’；STAT3引物序列：正义序列：5’CCTTTGGAACGAAGGGTACA-3’，反义序列：5’一CGCACTGGATCTGGGTCTTA-3’；内参3-actin引物序列：正义序列：5’-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3’；反义序歹0:5’-CGCGGCGATATCATCATCC-3’。

1.3统计学分析：应用SPSS17.0进行统计分析，计量资料 以均数±标准(i±s)差表示；3组间整体比较采用非参数检验的k Independent Samples。不同指标间的相关性分析 非正态分布用Spearman分析，正态分布用Pearson分析。

2结果
2.1各组Th17百分比比较：HZ组及PHN组Th17细胞百分比较对照组有所增加，HZ组高于PHN组（P<0.05）（表1）。