细胞与基因治疗加速崛起，质粒DNA有何优势？
文章来源：贤集网发布日期：2022-05-23浏览次数：122 基因治疗产品通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成，根据基因载体类型的特性差异，基因治疗产品主要可分为以病毒为载体的基因治疗产品、以质粒 DNA 为载体的基因治疗产品、RNA 类基因治疗产品，以及以细菌微生物为载体的基因治疗产品，其通过在人体细胞内，利用“细胞工厂”进一步表达产物或编辑细胞基因发挥功能。
质粒DNA基因治疗药物是以质粒DNA为载体的基因治疗产品。天然质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的遗传成分，绝大多数为环形双链DNA分子，能持续稳定地游离于染色体外自主复制，也可能在一定条件下可逆地整合到宿主染色体上随染色体的复制而复制，因此是基因克隆中常见的载体分子[2]。质粒本身可以携带外源目的基因用于质粒DNA基因治疗药物的开发，也是CAR-T、mRNA等细胞与基因治疗药物的基本原料，而且随科学技术的发展，质粒在医药、农业和环保、食品等领域都有了广泛应用。
何谓质粒DNA
质粒DNA能够广泛用于基因细胞治疗和核酸药物领域。
质粒包裹在宿主菌/大肠杆菌中，中间的一小部分就是质粒DNA。
从结构上看，质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。除了酵母的杀伤质粒是RNA质粒外，迄今为止所有的质粒无一例外都是属于这种类型的DNA分子。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋质粒DNA；开环质粒DNA和线性质粒DNA分子。
质粒DNA大部分都是双链超螺旋的闭合环状，少数是线性化的，且具有可转移性、可整合性，以及拷贝数，后者分为松弛型和严紧型两种状态。
质粒：细胞与基因治疗的关键起始物料和生产的主要成本来源
质粒具有共价封闭的环状结构，是独立于宿主染色体进行自主复制的核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，典型的质粒元件包括原核复制起点、抗性基因、多克 隆位点、启动子、目的基因筛选标记和目的基因，细菌质粒是细胞与基因治疗中 常用的质粒载体，用于大量扩增DNA片段、进行基因改造或者直接作为目的基因的 导入工具。
质粒作为绝大部分细胞与基因治疗产品的起始物料，其应用场景非常广泛。可作为 细胞与基因治疗载体直接作用于人体，也可用作病毒载体生产的原料或者mRNA疫 苗生产的模版。尽管质粒的工艺生产流程基本一致，但其不同的用途和在不同应用 场景的质量控制要求不同，决定了质粒的生产规模和纯度也是成本控制的关键。
质粒工艺化生产流程包括逐级放大的菌体扩增过程和下游纯化过程，细胞与基因治 疗中常用的载体AAV和慢病毒的生产都需要质粒作为起始材料，因此每年需要大 量符合质量要求的质粒来满足下游细胞与基因治疗的市场需求。质粒生产工艺中面 临的大挑战是大规模的生产放大和纯化，即要维持高超螺旋结构质粒的比例，又 要保持高纯度，以上两点无论对于DNA疫苗还是对于下游病毒生产的效率与质量 （如减少空壳率等）形成重大影响。
质粒通常在大肠杆菌中发酵扩增，提高大肠杆菌的生长密度可扩大质粒的产量。但 细菌密度增加会带来溶氧不足的问题，不仅会降低质粒产量，还会导致质粒质量下 降，具有超螺旋构象的质粒含量减少，给下游纯化工艺带来困难，也会间接提高生 产成本。对大肠杆菌发酵过程中的溶氧量问题进行优化后，可使质粒产量提高1至50 倍。
大肠杆菌的裂解包含化学方法（碱、洗涤剂、酶、渗透冲击）和物理方法（加热、 剪切、搅拌、超声波和冻融），其中碱性裂解是常用的方法。碱裂解步骤中，pH 的控制和适当有效的混合是关键，需要在狭窄的pH范围内使基因组DNA发生不可逆 变性且质粒双链需要保持完整，大规模质粒生产中，裂解过程往往工艺重复性差， 难以控制；该阶段的质粒对剪切力非常敏感，质粒损失较大，超螺旋也容易丢失， 影响产量和质量。
质粒生产过程中常用层析法或色谱法进行纯化，不同开发阶段和使用级别对质粒的 质量要求不同。质粒纯化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和内毒素以及非超 螺旋的质粒变体，以满足针对目标产品的使用要求，纯化过程的优化可提高质粒产 量、降低成本。质粒作为细胞与基因治疗药品的生产原料，需要对其理化性质进行 鉴别，确保目的基因序列及整合无误；作为关键原材料或终产品，需要对其功能进 行鉴定和控制；为保证安全性，对内毒素、杂菌污染和支原体残留的鉴别和检测的 周期往往约30天左右，决定着质粒生产批次放行的周期；此外，质粒因为无法终端 灭菌，因此需要全程在封闭且独立的生产车间进行，且要避免交叉污染，因此自动 化、封闭式的系统是未来趋势。
当使用高拷贝数质粒、采用优化的发酵工艺可获得约1-2g/L的质粒，但目前行业内绝大部分公司的质粒产量不到0.5g/L，工艺优化的空间还非常广阔。质粒由于结构 简单，且理化性质相似，因此构建一个平台化的生产和纯化工艺相对简单。质粒生 产周期较短，上游发酵和下游纯化罐装工艺约需6天，但质粒的质量控制约需30天（主 要对支原体等检测周期较长），质粒生产的年产能可达100批次。
综上，质粒生产的工艺优化对于提升质粒的产量和质量具有极大的意义，在大肠杆菌大规模发酵、质粒的提取和纯化工艺上，目前仍然具有非常广阔的优化空间。
质粒DNA基因治疗药物发展历程
基因治疗是随着20世纪六七十年代DNA 重组技术、基因克隆技术等的成熟而发展起来的具革命性的医疗技术之一，1972年Friedmann等[3]提出采用基因疗法作为治疗人类遗传疾病的手段，而质粒DNA在生物制药领域发展的突破性进展出现在1990年，Wolff等[4]将含有氯霉素乙酰基转移酶、萤光素酶和β-半乳糖苷酶基因的质粒盐溶液注入到小鼠的骨骼肌中发现，在这种“裸”质粒DNA分子中编码的报告基因在肌肉细胞中表达，该重大发现开启了将质粒DNA作为生物药物用于治疗或预防的可能性。纵观近30年的发展，质粒DNA基因治疗药物发展可以分为技术手段发展、临床试验探索以及上市应用3个阶段
技术手段发展（1990-1999）
• 1990年，Wolff等发现质粒DNA携带的目的基因可以在肌肉细胞中表达；
• 1991年，电穿孔技术应用于质粒DNA基因治疗药物的体内注射，以提高质粒DNA的转染效率；
• 1996年，CpG序列被设计于质粒载体中，以更好地激活DNA疫苗的免疫反应；
• 1997年，纳米颗粒技术应用于质粒DNA基因治疗药物；
• 1999年，快速大量注射质粒DNA溶液进行全身给药技术开始应用[5]。
2临床试验探索（2000—2010）
1994年，代号AT-0001的治疗质粒DNA基因治疗药物（目的基因为IL-2）在澳大利亚开展I期临床试验，用于恶性黑色素瘤的治疗，之后几年，研究者们陆续开展了临床尝试，大都宣告失败。2001年，代号JP-0010的质粒DNA基因治疗药物（目的基因为HGF）在日本开展I/II期临床试验，用于外周动脉缺血性疾病的治疗（该药物于2019年获得日本有条件上市批准）。截至2010年，质粒DNA基因治疗药物数量的临床试验累计达到约300个，约占基因治疗临床试验总数量的18%，适应症包括肿瘤、心血管疾病以及传染病等多个领域，尤其在缺血性疾病方面，质粒DNA基因治疗显示出较好的应用前景。
3上市应用（2011至今）
2011年，俄罗斯干细胞研究公司开发的血管内皮生长因子（VEGF165）裸质粒基因治疗药物（商品名为Neuvasculgen），在俄罗斯获批上市，用于治疗动脉粥样硬化引起的外周动脉缺血性疾病；2019年，日本AnGes公司开发的重组人肝细胞生长因子（HGF）裸质粒基因治疗药物（商品名为Collategene），在日本获得有条件上市批准，用于治疗阻塞性动脉硬化症和血栓闭塞性脉管炎；2021年，印度Cadila 公司开发的DNA疫苗ZyCoV-D获得紧急授权许可，用于预防12岁以上人群的重组2019新型冠状病毒感染。ZyCoV-D是世界上第一个被批准用于人类的DNA疫苗，预示着针对各种疾病的DNA疫苗的到来。
质粒DNA基因治疗药物研发现状
截至2022年4月份The journal of gene medicine的统计结果[6]，全球范围内质粒DNA基因治疗药物的临床试验共开展482个，占基因治疗临床试验总量的14.7%，仅次于以腺病毒以及逆转录病毒为载体的基因治疗临床试验数量
从目的基因角度分析，基因治疗药物使用的目的基因包括受体、抗原、细胞因子等，而质粒DNA基因治疗药物的目的基因主要集中于抗原、血管生长因子以及细胞因子，其中以抗原为目的基因的DNA疫苗的临床试验方案数量多，占比约36%，主要用于肿瘤及感染性疾病的治疗，血管生长因子类的数量次之，占比约21%，主要包括成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）等，具有促进血管新生的作用，主要用于治疗缺血性疾病。
从研发阶段上分析， 基因治疗药物的临床试验超过50%为Ⅰ期阶段，进入Ⅲ期的临床试验数量仅不到5%， 质粒DNA基因治疗药物所处各临床试验阶段的比例同上述数据基本一致，其中处于Ⅰ期临床试验阶段的超过250个，处于Ⅲ期阶段的仅有约20个方案，表明质粒DNA基因治疗药物仍然大部分处于临床研究的早期阶段。
