一项对复发髓母细胞瘤的研究揭示复发髓母细胞瘤的分子生物学特征

研究背景

经标准治疗后，约1/3的髓母细胞瘤（Medulloblastoma，MB）患者会出现复发，复发后患者长期生存的概率很低。但复发髓母细胞瘤的遗传学特征尚缺乏研究。了解复发髓母细胞瘤的关键分子生物学事件及其与初发肿瘤的关系是未来开发新治疗手段的关键。

近10年来，基因组学研究的发展揭示了髓母细胞瘤的分子生物学特征。每个分子亚型的遗传学机制，流行病学特征和预后不同。目前已经确定了一些有效的预后标志，如SHH型肿瘤中的TP53突变和MYCN扩增，G3型肿瘤中的MYC扩增。这为初发髓母细胞瘤的诊断和创新治疗提供了理论基础。然而，针对复发髓母细胞瘤的同类型研究较为缺乏，这主要是由于复发时接受手术的比例较低。本研究归纳了119例复发髓母细胞瘤的遗传学特征，确定了复发髓母细胞瘤的关键遗传学事件，并分析了它们在疾病进展过程中的演变。

研究方法

本研究共获取了来自英国CCLG的57例复发髓母细胞瘤样本（其中55例有对应的初发肿瘤样本）。另28例复发MB样本用于DNA甲基化分析。为明确髓母细胞瘤的诊断，除常规病理检查外，还进行了DNA甲基化分型。本研究中，4例样本因甲基化特征不符合MB而被排除（2例尤文肉瘤，2例GBM）。为扩大样本量，还获取了ICGC提供的38例复发MB的二代测序结果，因此本研究共纳入了119例复发MB。另外研究者对比了一项对282例初发髓母细胞瘤的研究数据（包括分子分型、DNA甲基化及基因突变数据）（Northcott PA et al, Nature, 2017）。

本研究对肿瘤进行分子分型，其中SHH型肿瘤细分为婴幼儿型（＜4岁，共10例）和非婴幼儿型。并分析了肿瘤染色体臂水平的拷贝数变异（CNV）和焦点拷贝数变异。其中焦点拷贝数变异共分析了63个关键基因所在的位点（＜12Mb）。在基因突变分析中，共分析了71个关键基因的突变，包括初发MB的高频驱动基因突变，以及在肿瘤复发时获得的致病性基因突变。CNV和基因突变的状态分为“获得”（初发肿瘤不存在，复发肿瘤存在）；“维持”（初发和复发肿瘤均存在）；“确诊时未知”（无法获得原发肿瘤数据，复发肿瘤存在）。另外研究者分析了与复发MB相关的信号通路的改变。

研究结果

1、肿瘤的分子分型（分子亚型）在复发时保持恒定

肿瘤的分子分型（包括新的分子亚型）在复发时与初发一致，但也有例外。在57例可进行DNA甲基化分析的肿瘤中，56例（98%）在初发时和复发时的分子亚型一致。在SHH型中，18/20（90%）例肿瘤的分子亚型在复发时与初发一致。在G3&G4型中，4例肿瘤的分子亚型在复发时发生改变（4/24）。在初发时均为VIII亚型，而复发时3例变为V亚型，1例变为VII亚型。无高频的分子遗传学改变与上述亚型的变化现象相关。

2、复发MB的预后与分子分型和复发时是否接受CSI相关

正如预期的那样，在有生存数据的患者中，不同分子分型的患者从确诊到复发的时间间隔有显著差异（p=0.002）。分子分型也与复发后的疾病进展有关。

3、复发时遗传事件的产生和维持在不同分型之间存在差异

在复发MB中，拷贝数变异CNVs和驱动基因突变较初发肿瘤发生了显著的变化。总体而言，40%（239/597）的遗传学事件是新发的。但大多数遗传事件（60%）与初发肿瘤保持一致。复发MB遗传事件改变的类型以及频率在不同分型之间也存在显著差异，其中G4型的改变多，而WNT型和G3型的改变相对较少。总体而言，在复发时获得的致病性基因突变的总量在各个亚组之间是相等的。

4、各型肿瘤在复发时的遗传学特征

☆ SHH婴幼儿亚型和SHH非婴幼儿亚型在复发时遗传学特征不同

SHH婴幼儿亚型和非婴幼儿亚型在复发时获得的遗传学改变在类型和频率上存在差异，非婴幼儿亚型在复发时染色体臂层面的改变多于婴幼儿亚型（59%,70/119 vs 32%,20/62，p＜0.001）。但是，与婴幼儿型相比，非婴幼儿型获得的肿瘤驱动基因突变明显较少（7%,5/72 vs 32% 13/41，p=0.001）。SHH通路相关基因突变在这两型中均较为常见，且在复发时得以保持（婴幼儿型6/6，非婴幼儿型6/8）。

在SHH婴幼儿亚型中，关键驱动基因突变和CNVs的数量在复发时没有显著的增加，本研究中33%的复发肿瘤（4/12）存在15号染色体的获得，而对照初发队列未发现此改变（0/23）。在SHH非婴幼儿亚型中，复发时染色体臂层面CNVs显著增多（p=0.044）。与初发肿瘤相比，复发肿瘤染色体4p/4q获得和10p缺失明显增多。复发时焦点CNV和驱动基因突变的数量没有显著增加。但TP53突变除外（复发8/19 vs 初发6/59；p=0.004）。TP53突变肿瘤染色体臂层面CNVs数量增加（突变型8.14 vs 野生型3.8）。未观察到MYCN扩增在复发肿瘤中的增加。

☆ TP53突变在复发WNT型肿瘤中普遍存在

复发时WNT型肿瘤常见的遗传学改变是6号染色体单体和CTNNB1突变（5/5，100%），并得以保留。4例肿瘤存在TP53突变，并从初发时得到保留。与对照的初发肿瘤相比，TP53突变的比例明显较高（对照组3/24）。

☆ G3型肿瘤在复发时出现新的遗传事件较少

复发G3型肿瘤中新出现的驱动基因突变和焦点CNV较少，但与初发队列相比，染色体2q获得和15号染色体丢失的比例较高。

☆ G4型肿瘤在复发时出现新的遗传事件较多

G4型肿瘤在复发时的遗传学特征与初发时的差异大。复发时基因突变和CNV的数量明显增多。在染色体臂水平，复发肿瘤17p和11p缺失的比例较高（20/25和10/25），主要是从初发时维持至复发。而复发时9p、10p、20p和20q的缺失也明显增多，主要是在复发时获得。复发G4型肿瘤出现焦点CNV事件很少，但CDK6和CDK14的共扩增明显增多，这一改变主要在复发时获得，并出现在21%（4/19）的肿瘤中。初发G4型肿瘤的驱动基因突变较少，但复发肿瘤中可发现数个高频突变，其中USH2A、DDX3X、CHD7、NEB、EPHA7、GTF3C1的比例明显高于初发队列。值得注意的是，致病性的USH2A突变常见（图4F），在复发G4型肿瘤中的比例为17%（4/23），其中2例自初发时维持，另2例在复发时获得。而初发肿瘤中未发现该突变。

5、复发MB的信号传导通路存在异常

复发MB中存在某些关键信号通路的改变，包括染色质修饰、PI3K-Akt、细胞周期和DNA损伤修复（DDR）相关通路。研究者对具有完整基因突变和CNV数据的29例肿瘤的信号通路的改变进行研究。共55%（16/29）的复发MB存在DDR/细胞周期相关通路的改变，除TP53突变外（7/29），其他DDR通路相关基因的高频突变包括ATM和BRCA2突变。DDR相关基因的改变在所有分型中均可见，但主要发生于SHH非婴幼儿亚型和G4型，主要由初发维持至复发。55%（16/29）的复发MB存在与染色质修饰通路相关的异常事件，在所有分型中均常见，主要在复发时获得。但没有高频基因突变，主要由一系列低频事件引起。PI3K-AKT通路的改变发生于28%的肿瘤（8/29），在所有分型中均可见，主要在复发时获得。PTEN突变或CNV常见（3/29，10%）。

6、特定的遗传学事件可预测复发MB的预后

肿瘤复发后的生存时间与分子分型相关，另外，在单因素分析中，TP53突变、MYCN扩增和3p缺失与较差的预后相关（图6）。TP53突变是复发时常见的不良预后事件（9/36,25%）。所有存在该突变的患者复发后生存时间小于2年。值得注意的是，在单因素分析中，肿瘤解剖部位，复发时接受的治疗（化疗，局部或全中枢放疗）与预后无关（补充表3）。多因素分析确定了TP53突变为不利的独立危险因素，而染色体9q缺失是有利的独立危险因素。与复发肿瘤预后相关的4个改变：TP53突变、MYCN扩增、3p缺失、9q缺失中，有40%是复发时获得的。

讨论

了解髓母细胞瘤复发时遗传学特征的变化对指导治疗和改善预后至关重要。大多数复发肿瘤的分子分型和亚型与原发肿瘤一致。Kumar等的研究报告了69例复发G3和G4型MB中有15例发生亚型改变，并与MYC扩增和染色体2p获得相关。但此类病例数量较少，因此这一现象的生物学特征和临床意义有待进一步研究。在分子分型保持一致的前提下，肿瘤驱动基因的突变以及CNV的出现和维持是复发髓母细胞瘤的主要遗传学特征。

本研究发现，复发髓母细胞瘤中约40%的遗传学事件是在复发时新获得的，而且在不同亚型之间有显著的差异。非婴幼儿SHH型肿瘤在复发时染色体臂水平的CNV明显增多，并与TP53突变相关。而G4型肿瘤在复发时出现的遗传学改变多，包括CDK6/CDK14和USH2A突变，这提供了潜在的靶向治疗机会。USH2A突变的发现可能提示G4型肿瘤复发的新机制，特别是考虑到该基因的异常在其他疾病（如视网膜色素变性和Usher综合征）的作用。另外，复发髓母细胞瘤中60%的遗传学事件在初发时即存在，包括WNT型和SHH型通路相关基因的突变（CTNNB1、PTCH1、SUFU、SMO等）。这些关键基因突变的维持提示它们在肿瘤发展的全程中发挥作用，因此一旦发现，可在整个病程中指导靶向药物的选择（如SMO抑制剂）。本研究中，大多数WNT型肿瘤（4/5）在复发时存在TP53突变，这与既往研究形成对比，即TP53突变在WNT型肿瘤中与预后无关，这一点需要进一步研究。

另外，复发髓母细胞瘤存在特定分子通路的改变，如DNA损伤修复、染色质修饰、PI3K-AKT信号通路。这为进一步研究与信号通路相关的治疗手段提供了机会。另外，复发后特定的遗传学事件，如TP53突变、MYCN扩增、3p缺失、9q缺失与预后相关。这提示在肿瘤复发时也有必要进行分子病理检测，以指导治疗。