抗体药物研究新热点 l 双特异纳米抗体

双特异抗体  

1997年第一个单克隆抗体药物被批准上市以来，肿瘤CAR-T治疗、中和抗体抗病毒疗法、免疫、代谢疾病治疗取得飞速发展，遗憾的是批准的单抗药物在进入临床单抗的比例正在逐年递减，抗体药物研发亟需转换方向。自1960年Nisonoff 及其合作者提出双特异抗体（BsAb）的概念，BsAb药物Catumaxomab于2009年被欧盟批准上市，给抗体药物研发领域带来曙光。发展至今，不同的双特异性抗体在实验室被成功构建，但由于VH和VL融合的错误产物比例过高应用于生产难度大，因此双特异抗体的研发仍具挖掘空间。

双特异纳米抗体

纳米抗体（Nanobody）是由比利时科学家于1993年在自然杂志中报道，只包含一重链可变区VHH，得益于小分子量（15KDa）、与人源VHs高度同源以及稳定性高等优势，近年来纳米抗体药物研究发展尤为迅速。为解决纳米抗体成药性的问题，纳米抗体工程改造集中在增加纳米抗体效价与在体内稳定性。通过基因工程、化学方法的改造，构建出多样的纳米抗体融合分子，例如融合了Fc的纳米抗体片段能够有效激活体内ADCC效应，融合人血清蛋白（HSA）能有效延长纳米抗体在体内的半衰期，从而改善药代动力学特征[2]。值得关注的是利用纳米抗体可以构建出的双特异性抗体分子，仍能够保持其组织渗透性，因此双特异纳米抗体在抗体工程研究领域具有非常广阔的前景[1]，并且在与其他抗体片段或是与非抗体片段融合方式上，纳米抗体体现了更多样性的分子结构，设计出的多价多特异抗体联合分子，在肿瘤治疗、免疫疾病等领域也获得更好的效果[3]。

双特异性纳米抗体构建策略

1、VHH与VHH的融合

利用VHH hinge区序列或是li[x]nker连接肽，连接两个以上纳米抗体分子，直接构建出双特异性纳米抗体。小的双特异抗体（Tandem）由一段短肽将两个纳米抗体分子头尾相连，Zhimin Xu[4]利用(G4S)3构建出anti-EGFR/CD16/HSA双特异靶向重组纳米抗体，不仅延长了纳米抗体的半衰期，在体内具有抗肿瘤作用。Linlin Ma[5]等成功构建4价PD-L1/TIGIT双特异纳米抗体，相较于单价抗体具有更高的阻断活性。构建抗免疫球蛋白纳米抗体，同样能延长纳米抗体在体内的半衰期[6]。

2、VHH与其他抗体片段融合

VHH可与IgG1 的CH1和Cĸ/Cλ片段融合，替代VH与VL片段，获得VHH-ba[x]sed 单价类IgG 双/三特异性抗体[7]。VHH与Fc融合的双特异抗体分子量大约80kDa，也远远小于全长IgG（~150kDa），使得其不仅具有IgG相同的功能效应，还具有更高的组织渗透性。VHH与Fab或ScFv组合，实现更多样性、高潜质的双特异抗体分子。

靶点研究

双特异抗体的研究主要靶向肿瘤环境抗原以及激活免疫活性，以PD-1/PD-L1与CTLA-4为代表肿瘤治疗方案的成功使得双特异抗体更加具有研究前景。安进公司设计的双抗T细胞激动剂（BiTEs）是抗体激活T细胞杀死肿瘤细胞的成熟技术，然而使用纳米抗体研发的类BiTEs分子会更小，高度模块化的纳米抗体也能适应多种肿瘤的治疗。一般来说，抗肿瘤双特异靶点研究主要集中在以下三个方向：

01

靶向免疫细胞：anti-CD3纳米抗体能够激活T细胞，anti-CD3融合抗肿瘤抗原的双抗纳米抗体，既具有CAR-T的效果，还降低了体内免疫反应。构建同时识别肿瘤细胞抗原与NK细胞表面受体CD 16a的双特异抗体可以增强体内ADCC效应[8]。

02 靶向肿瘤细胞抗原：通过抗体靶向肿瘤细胞受体，激活T细胞加强抗肿瘤疗效，EGFR、CD19、CEA、Her2都是近年来研究热门靶点。

03

靶向肿瘤环境：肿瘤细胞会在体内形成复杂的肿瘤微环境，尤其在实体瘤治疗中，免疫细胞很难进入肿瘤微环境，并且环境中的免疫细胞也会被抑制,靶向肿瘤环境抗体更适应临床实体瘤的治疗。

双特异抗体按照靶向分类有三种不同设计方案，一是单独靶向肿瘤细胞，二是单独靶向免疫细胞。但就目前双特异抗体研究来看，还没有靶向单独肿瘤细胞或是单独免疫细胞的成功案例，因此大部分研究都基于第三种设计方案，即肿瘤细胞和免疫细胞双靶向联合，激发靶向性免疫反应[10]，例如利用anti-PD-1、anti-CTLA-4能够激活T细胞免疫应答，并且防止肿瘤的免疫逃逸。Pallavi Bhatta[11]等通过体外构建Fab-KD-Fab融合蛋白文库，高通量筛选成功构建了具有联合抑制B细胞活力作用的anti-CD79a/b和anti-CD22双特异抗体。

通过激活免疫细胞可以对抗肿瘤，相反通过抑制免疫应答可以治疗慢性炎症等免疫性疾病。OX40/XO40L是调节免疫检查点重要通路，XO40与XO40L结合能够促进T细胞增值并且抑制调节型T细胞作用[12]，利用anti-OX40L阻断与配受体结合，能够抑制Th2细胞介导的免疫反应[13]。

表 1 部分双特异纳米抗体专利靶点(公开资料）

 总 结  

纳米抗体的应用，远不止于肿瘤治疗，在免疫疾病治疗、抗体中和毒素领域均有优异的表现。另外相较于传统抗体，纳米抗体天然缺失轻链，极大简化了分离纯化步骤，进而提高了产品质量。双特异性纳米抗体兼具双特异性抗体与纳米抗体的双重优势，不仅具有更强的亲和力，延长了纳米抗体在体内的作用时间，并且在防止耐药、免疫逃逸方面都具有独特的优势。