全外显子基因测序在无精子症遗传学病因诊断中的临床应用研究

随着分子生物学技术的大发展，特别是基因测序技术的成熟和临床应用，将全外显子基因测序（whole exome sequencing，WES）技术应用于无精子症的遗传学病因诊断，拓宽了基因突变在该病发病机制中的重要作用和认知范围，不仅给无精子症潜在的病理生理学研究带来曙光，而且也为临床上更有效的和诊断与治疗提供了技术支撑。

一、无精子症的患病情况、病因及其诊断方法

大约7%的男性受到不育症的影响，通过精液检测能够确定精液异常类型并初步对不育症进行诊断学分类。有文献认为无精子症占不育症患者的19%～30%，这些患者病因明确的少于半数，其中基因或者遗传性疾病、Y染色体特定异常是主要因素，因此需要积极寻找不育症的病因[1]。不育症男方因素中20%～25%为已知的基因因素，约有521个基因与男性不育症的单基因病因存在相关性[2]。

无精子症是指精液中无精子，至少要进行3次以上严格的精液采集和检查，且所有显微镜检查未见精子的精液标本都应离心确定沉渣中无精子。

无精子症的病因复杂，概括分为两大类，一是睾丸本身生精功能障碍，称为原发性无精子症或非梗阻性无精子症（nonobstructive azoospermia，NOA）；另一种是睾丸生精功能正常，但由于输精管道阻塞或先天性输精管缺如而导致产生的精子不能排出体外，称为梗阻性无精子症（obstructive azoospermia，OA）。

无精子症的诊断需要基于病史、体格检查、精浆生化、生殖激素、染色体及基因检查、影像学检查和睾丸组织活检等综合判断与分析，虽然上述常规方法能够初步鉴别NOA和OA，然而，由于多数无精子症的病因不能明确，从而不能确立的治疗方案。40%的不育症患者的病因仍然不明确（可称为特发性病例），需要运用新的检测和诊断方法寻找病因，其中全外显子基因测序（whole exome sequencing，WES）方法或许可以揭示一部分潜在的遗传学病因。

二、全外显子基因测序在无精子症遗传学病因诊断中的应用

WES属于第二代测序，通过外显子DNA序列芯片或探针，将基因组中外显子区域的DNA序列捕获后集中进行高通量测序，主要步骤包括：

（1）目标区域序列的富集；（2）DNA测序；（3）生物信息学统计、筛选出候选基因、Sanger法验证，找到致病基因。

虽然WES捕获探针仅能覆盖人类基因组的1%～1.5%，却涵盖了与基因功能相关的绝大多数功能性变异，即使只对编码区域进行高通量测序，依然能解释至少85%的致病基因多态性或者变异，WES被认为是一种性价比高的高通量技术。

在过去的数年中，WES技术得到不断改进，现在正迅速进入临床实验室，已有许多常染色体隐性遗传疾病的致病基因被找到，从而改变了临床检测和诊断的格局[3,4]。

过去的20年，应用于诊断男性不育症的常规遗传学分析方法没有变化，无精子症的传统遗传因素检测方法包括染色体核型分析、Y染色体微缺失、CFTR基因突变等检测，但是仅能解释20%的遗传学原因，寻找潜在的遗传学病因从而促进临床工作显得尤为迫切。重度少精子症（＜5×10^6/ml）和无精子症等的精子计数异常是染色体核型和Y染色体微缺失检测的指征，而候选基因的突变筛查指征为特殊的精液或者睾丸表型。采用WES技术发现导致不育症的突变基因是研究热点之一，本文将概括的综述WES在无精子症诊断和疾病研究领域寻找遗传学病因的新进展和新发现。

三、WES在NOA遗传学诊断中的应用

NOA在男性中的患病率约1%～2%，在不育症患者中患病率约10%～20%。大多数NOA患者的病因是未知的，既往仅有几个基因突变被确认为其病因。现将近年来新报道的基因突变综述如下。

1. NOA与减数分裂过程有关的新发基因突变：

在临床上25%的无精子症患者可观测到减数分裂期阻滞，但是发生所有的精曲小管中纯粹同质性阻滞（或许由于单一基因的突变所致）的较少，由于大量的基因作用于减数分裂过程，因而产生广泛的遗传异质性。Gershoni等[5,6]利用WES或全基因组测序法（whole genome sequencing，WGS）鉴定出MEIOB、X连锁外显子睾丸表达基因14（Testis-expressed gene 14，TEX14）和DNAH6等3个无精子症突变，分别与减数分裂交换、子代细胞脱落、可能的快速前期运动等不同减数分裂过程相关。MEIOB基因编码减数分裂过程中DNA双链断裂修复所需的单链DNA结合蛋白，其特异的在人类和小鼠睾丸表达，MeioB敲除小鼠由于减数分裂阻滞而出现无精子症。

该作者新发现MEIOB基因纯合移码突变，其导致MEIOB蛋白截短，进而保守的C端DNA结合域缺乏。另有报道[7] 2例血亲家庭NOA和减数分裂阻滞的兄弟患有编码减数分裂双链断裂形成蛋白1基因（meiotic double-stranded break formation protein 1）的纯合错义突变（MEI1；c.C3307T:p.R1103W），另1例弟弟为杂合突变；已有MEI1敲除与减数分裂阻滞相关的小鼠动物模型，这表明该突变是有害的。

多数真核生物的减数分裂同源重组由2种重组酶系统介导，即参与有丝分裂和减数分裂的RAD51及减数分裂特异的DMC1；RAD51对于人类减数分裂的作用尚不清楚；小鼠敲除Rad51或者任何旁系同源Rad51，均呈现胚胎致死性。

Yang等[8]使用纯合性基因定位和WES检测1个患有减数分裂阻滞、无精子症的血亲家庭，发现1个旁系同源RAD51基因的1bp纯合置换异常（c.41T＞C/p.Leu14Pro），命名为XRCC2。

通过CRISPR/Cas9方法制作的携带Xrcc2-c.T41C/p.Leu14Pro突变的基因敲入小鼠，纯合性突变可以存活，呈现减数分裂阻滞、无精子症、卵巢早衰（primary ovarian failure，POF）和不育症。

基质抗原3基因（stromal antigen 3，STAG3）编码的减数分裂特异蛋白对减数分裂黏连蛋白复合物的功能性至关重要，已知STAG3序列变异导致雄性和雌性小鼠的减数分裂阻滞、人类POF，但是对于男性不育症患者的意义尚不清楚。van der Bijl等[9]报道，2个导致完全减数分裂阻滞和不育症的STAG3基因复合杂合变异c.[1262T＞G]；[1312C＞T]和p. [（Leu421Arg）]；[（Arg438Ter）]；Stag3基因敲除小鼠的生殖细胞发育不超过偶线期，显示极端的染色体畸变；这表明STAG3变异负面影响蛋白功能是NOA一个少见的原因（＜1%）。

SYCE1基因编码联会复合体中心成分1（synaptonemal complex central element 1，SYCE1）蛋白作用于减数分裂期间联会复合体的形成，Syce1缺失雄性和雌性小鼠罹患不育，人类SYCE1突变引起POF和NOA。Pashaei等[10]新发现SYCE1基因的剪接位点突变c.375-2A＞G，突变影响该基因内含子6中的受体剪接位点，导致无精子症和不育症。

2. 无精子症有关的X-连锁基因的新发突变：

TEX11是减数分裂重组和染色体联会所必需的基因，缺乏将导致减数分裂阻滞、无精子症和不育症。

Sha等[11]在2例无精子症兄弟新发现TEX11突变（2653G → T, in exon 29 GenBank accession number，NM_031276），为同一外显子的错义突变（W856C），但其母亲没有携带；患者的睾丸活检组织学揭示减数分裂阻滞，在精曲小管中没有减数分裂后的圆形精细胞和成熟精子，TEX11在精原细胞强表达和精母细胞弱表达，但是在支持细胞和间质细胞没有表达。

Okutman等[12]检测2例无精子症患者，发现X连锁黑色素瘤抗原家族B4（melanoma antigen family B4，MAGEB4）基因突变，为单碱基替换（c.1041A＞T）和非终止突变，导致C-羟基端增加24个氨基酸；功能试验没有发现影响mRNA稳定性、蛋白细胞内定位以及与其他MAGE蛋白的同型或异型二聚体化，增加的氨基酸影响特有蛋白与MAGEB4配偶体之间的互相作用。

3. 在睾丸特异表达的新发基因突变：

Fakhro等[13]报道5个在NOA患者睾丸特异表达的、有害的、与疾病分离的隐性变异（CCDC155、NANOS2、SPO11、TEX14和WNK3），小鼠功能研究证明这些基因在精子发生中发挥作用。

在75例NOA患者中，有5.3%携带这些新发现的基因隐性变异，8.0%携带既往报道的NOA基因有害变异，13.3%患者存在遗传学病因，而可生育的对照组则为0；说明WES可以发现NOA患者的一部分遗传学病因（家族性＞50%，散发性＞10%）。

Araujo等[14]在6例NOA患者鉴定出7个基因的潜在致病变异，鉴定出2个已知与无精子症相关的DMRT1基因变异c.671A＞G（p.（Asn224Ser））和 REC8基因变异c.91C＞T（p.（Arg31Cys）），发现的新变异包括已知中等证据、与精子发生障碍有关的TEX15和KLHL10，有限证据的DNMT3B和TEX14，迄今为止没有证据、有希望成为候选基因的SYCE1L。

4. 在睾丸和卵巢均可发挥作用的新发基因突变：

He等[15]发现DMC1基因的纯合错义突变（NM_007068.3:c.106G＞A，p.Asp36Asn）为1个家族NOA和POF患者表型的共同异常，导致DMC1基因修改的H3TH基序中保守的天冬氨酸残基与天冬酰胺发生置换，从而引起蛋白错误折叠。

研究证实患者精曲小管内缺乏精子，精子发生阻滞于减数分裂前期Ⅰ期的偶线期。

Jaillard等[16]报道1例POF