热休克蛋白27在人胸主动脉夹层的表达研究

【摘要】  　　目的：探讨热休克蛋白（heat shock protein, HSP）27在胸主动脉夹层（thoracic aortic dissection,TAD）中的表达情况，并初步了解其在TAD中的可能作用。方法：组织化学染色检测TAD病理特征，免疫组织化学染色检测HSP27在动脉壁中的表达和定位， Western Blot验证其表达，并分析HSP27表达与TAD患者临床病理参数如直径、高血压和炎症反应等的关系。结果：Western blot和免疫组化染色均显示HSP27在两组标本中均有表达，TAD组表达较正常组减低。HSP27蛋白主要位于中膜和外膜小血管和炎性细胞的胞质。相邻切片α肌动蛋白表达分布与HSP27基本一致。HSP27表达与其直径、患者高血压、急慢性病程和年龄等参数无明显相关性，这可能与例数较少有关。结论：HSP27蛋白在TAD中表达减少，中膜平滑肌细胞（smooth muscle cell, SMC）是其主要细胞来源；HSP27可能通过调节肌动蛋白和SMC的功能等机制在TAD发挥作用，需进一步研究证实。

【关键词】  胸主动脉夹层·热休克蛋白·血管平滑肌细胞

　　 ex[x]pression of heat shock protein 27 in human thoracic aortic dissection

    LIAO Ming-fang, CUI Jia-sen, ZHANG Jian, WANG Liang, LIU Yan-ling, BAO Jun-min, JING Zai-ping

    Department of Vascular Surgery, Changhai Hospital  （Shanghai  200433, China）

    【ABSTRACT】 ob[x]jective: To find HSP27 potein ex[x]pression changed in thoracic aortic dissection （TAD） compared with normal control by differential proteomics approach. This study was performed to investigate the ex[x]pression and localization of HSP27 and its possible roles in TAD. Methods: Histology and immunohistochemistry were performed to detect the ex[x]pression and localization of HSP27 protein in dissected thoracic aortas and normal controls. Western Blot was used to invalidate its ex[x]pression. Then the correlation between HSP27 ex[x]pression and some clinical parameters such as diameter and hypertension were analyzed. Results: Western blot and immunohistochemistry showed that HSP27 ex[x]pression decreased in TAD compared with normal controls. HSP27 protein mainly localized in the media. Contiguous slices of TAD showed similar ex[x]pression and distribution between alpha actin and HSP27. There was no significant correlation between HSP27 protein ex[x]pression and clinical parameters including ages, diameters, hypertension and inflammation, which might be related to the small sample size. Conclusions: HSP27 protein ex[x]pression decreased in TAD and SMC was the main cellular resource. HSP27 may play important role in TAD through some mechanisms such as regulating SMC and actin function, which need further research.

    【KEY WORDS】 Thoracic aortic dissection·Heat shock proteins·Vascular smooth muscle cells

    　　主动脉夹层（aortic dissection, AD）是累及主动脉灾难性的疾病，主要发生在胸主动脉，称胸主动脉夹层（thoracic aortic dissection, TAD）。近年TAD的发病率呈上升趋势，发病年龄趋向年轻化，TAD一旦破裂死亡率极高，是严重危害中老年患者生命的主要心血管疾病之一［1］。随着腔内血管外科理论和技术的发展，TAD的治疗已经取得了较大的进展，部分TAD患者已从传统的开放性开胸人工血管置换术转向微创的腔内隔绝术［2］，降低了病死率及各种手术并发症率。尽管这些方法能较有效的治疗TAD，仍有许多患者在明确诊断前或得到手术治疗之前已经破裂死亡，尤其是急性主动脉夹层破裂，是猝死的重要原因之一［１，３］。因而，从发病机制水平进行TAD的预防、诊断和治疗的研究具有非常重要的意义，而目前对TAD发病机制的认识仍处于初步阶段。本研究前期研究应用差异蛋白质组学方法对TAD夹层撕开动脉和正常人胸主动脉壁中膜的蛋白质组进行比较分析,发现两组动脉壁组织中的热休克蛋白（heat shock protein, HSP）27表达存在差异。本研究在差异蛋白质组学研究的基础上进一步验证HSP27在TAD中的表达与定位，并初步分析其在TAD中的可能作用。

    1　材料与方法

    1.1　标本采集　实验标本为 TAD 患者的夹层撕开动脉壁（dissected aorta, DA）和正常人胸主动脉壁（normal aorta, NA）。收集我院 2003～2005 年行人工血管置换术的TAD患者 6 例，获取新鲜胸主动脉夹层标本。患者均为男性，中位年龄48.1岁，均诊断为急性DebakeyⅠ型夹层，MRA或CTA显示升主动脉平均大直径为（5.62±1.3）cm，其中合并高血压者 5 例（83.3%），无马凡综合征等先天性疾病。大体标本观察动脉环明显扩张，约 1/2～2/3 的动脉环可见夹层撕裂，假腔内可见血栓，其中 5 例标本的内壁可见程度不等的米黄色粥样硬化斑块。从器官移植供者中获取正常新鲜升主动脉 6 例，均为男性，平均年龄（39.5±7.2）岁，动脉平均直径（2.48±0.3） cm，均无主动脉夹层和动脉瘤等血管疾病史。大体观察动脉环呈圆形，弹性较好，动脉壁完整，其中有2例可见轻中度的粥样硬化斑块。

    　　人TAD动脉壁石蜡包埋标本15例（包括上述6例异常标本，其余9例来源于主动脉切除人工血管置换术的TAD患者），男13例，女2例，中位年龄45.5岁。正常对照为正常人胸主动脉石蜡标本10例（包括上述6例正常标本，其余4例来源于尸检和器官捐献者），男8例，女2例，中位年龄38.3岁，除上述2例外均无主动脉疾病。

    1.2　标本处理　获取新鲜标本后，用预冷的生理盐水冲洗数遍，洗净附在血管壁上的血液和附壁血栓，按实验分组剪取所需标本浸入4%甲醛保存，其余标本分装后做好标记立即置于液氮中保存备用。

    1.3　苏木精－伊红染色（HE 染色）和维多利亚兰染色（VB 染色）4％ 甲醛固定、脱水、组织浸蜡、包埋，连续切片 5 μm 厚。染色按常规操作进行。

    1.4　免疫组织化学染色　对同一标本的相邻切片分别进行各指标的免疫组化染色（室温下完成），采用二步法免疫组织化学检测试剂盒（GBI, USA），基本流程按常规操作。一抗为抗人HSP27单克隆抗体和兔抗人α肌动蛋白抗体，按1∶100稀释，DAB显色。实验对照设立：1）空白对照：用PBS代替一抗作阴性对照，结果为阴性。2）替代对照：用正常未免疫血清代替一抗作阴性对照，结果为阴性。3）用已阳性组织作阳性对照，结果为阳性。应用Leica显微镜及Qwin 550图像采集卡进行图像采集，镜下阳性蛋白为黄色、棕黄色或棕色颗粒样沉淀。按以下标准进行判断统计，在400倍显微镜下随机取10个视野，计算阳性蛋白百分比（阳性细胞数占细胞总数的百分比），然后进行综合评分（由两人分别进行判断统计）。两分相加：0 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为中度阳性（++），6～7 分为强阳性（+++）。α-SMA 染色及结果和炎症反应程度的判断同 HSP27。

    1.5　Western 印迹法　每个样品等量上样于12％聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳，然后转膜、抗体结合及染色。按常规操作进行。

    1.6　统计学分析　用SPSS10.0软件进行分析，HSP27 的染色强度与病例的临床参数如直径、年龄和高血压等参数应用 Cochran-Mantel-Haenszel（CMH）χ2 进行统计学分析。

    2　结果

    2.1　组织化学染色　HE和VB染色结果显示正常人胸主动脉管壁结构完整，内膜完整，管壁平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMCs）数量较多（图1 A），VB下可见完整内弹力膜，弹力纤维呈蓝色，位于中膜排列整齐，未见弹力纤维断裂，胶原纤维呈红色，在中膜及外膜均有显色，主要位于外膜（图1 B）。TAD动脉壁HE染色可见明显夹层，夹层中可见血栓或血液，SMC变性、肿胀，纤维组织增生、胶原化，部分区域黏液样变性，外膜血管增生，外膜及夹层撕开周围区域可见程度不等的淋巴细胞、中性细胞和浆细胞浸润，部分动脉壁可见较多空泡细胞、胆固醇结晶等（图1 C）。TAD动脉壁VB染色可见平滑肌弹力纤维断裂，减少甚至部分消失，外膜胶原纤维增生（图1 D）。

    2.2　HSP27 蛋白的免疫组织化学染色　免疫组织化学结果显示 HSP27 在 NA 和 DA 中均有表达（图2），而Western Blot显示TAD组的HSP27表达较NA组减低（图3）。HSP27 表达位于胞质，主要定位于中膜和外膜小血管。同一组织相邻切片的α－SMA染色显示与 HSP27 表达分布相一致，提示主要由 SMC 表达。TAD 的 HSP27 表达除中膜和外膜血管外，炎性细胞区域亦有表达。另外可见 TAD 中外膜交界处夹层撕开层面两边有一条带，为HSP27阴性染色区，该条带内的细胞核及α肌动蛋白染色亦明显减少。

    2.3　Western blot 结果显示　NA 组的 HSP27 表达高于DA组（P<0.05），见图 3 。

    2.4　HSP27 表达与临床指标相关性分析　将 15 例 TAD 动脉壁的 HSP27 染色强度与各项临床病理等参数进行相关分析，CMH χ2 检验，结果显示HSP 染色强度与动脉壁炎症反应程度、动脉直径、年龄、急或慢性病程、高血压及马凡综合征无明显相关（P均＞0.05，表1）。将炎症反应程度与急慢性病程及高血压进行相关分析（表2），显示 DA 中炎症反应程度与急慢性病程相关（P<0.05），而与高血压不相关（P>0.05）。

    3　讨论

    　　TAD 指主动脉腔内血液通过主动脉壁上的内膜撕裂口进入主动脉中膜外层或中外膜交界处，使主动脉壁裂开为两层，夹层可沿主动脉纵轴延伸，形成动脉瘤，甚至破裂。其发病机理可简单概括为动脉壁本身病变和血液动力学两大因素共同作用，本研究主要聚焦在动脉壁本身的病理变化因素。本研究前期应用蛋白质组学方法比较了DA和NA中膜的蛋白质，发现两组动脉壁的HSP27表达有差异，提示其可能在TAD发病中具有重要作用。

    　　HSPs 是一组糖蛋白，作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、装配、运输和降解等过程，具有多种生物学作用，主要有保护热变性的蛋白质，稳定细胞结构及参与免疫应答等［4，5］。除了在病变局部发挥作用，亦可以一种可溶形式释放到血液中发挥作用。HSP27 是亚家族中的重要一员，是人细胞中发现的一种相对分子质量为 27×103 的HSP，它具有 sHSP 亚家族的显著特点：形成相对分子质量为（400～800）×103的寡聚体。该寡聚体的解离与聚合因其生物学功能不同而异，如调节细胞间的活性氧、维持谷胱甘肽水平时需聚合成寡聚体，而行使分子伴侣功能时则需解聚。　　

    　　HSP27与其他所有的HSP 一样，保护细胞免受各种应激因素损伤。相对于其他 HSP 亚型，其在血管疾病中研究并不太多。Martin－Ventuna等［6］研究颈动脉内膜斑块和正常对照乳腺动脉HSP27分泌的差异情况，结果显示动脉粥样硬化斑块分泌的 HSP27的表达较正常对照明显减少，血浆可溶性 HSP27浓度亦低于正常对照组，免疫组织化学检测发现人动脉粥样硬化斑块和对照乳腺动脉均表达 HSP27，内皮细胞和血管 SMC 均可表达HSP27，主要由SMC表达，提示HSP27可作为动脉粥样硬化的可能标志。同种异体心脏移植血管病变（cardiac allograft vasculopathy, CAV）是心脏移植后的主要并发症，De Souza 等［7］亦用差异蛋白质组学方法研究心脏移植后无CAV和有CAV的心肌组织的差异蛋白质，发现其中HSP27存在明显差异，应用免疫组织化学验证结果显示无CAV组表达HSP27且主要定位于血管，并主要由 SMC 表达，而有 CAV 组几乎无 HSP27 表达，表明 HSP27 特异性的去磷酸化形式与正常血管有关，而在移植血管病变患者的血管则少或无表达。本实验结果与Martin-Ventura［6］和De Souza［7］等的研究报道基本一致，病变动脉HSP27表达减少，且主要由SMC表达，由于大多数TAD动脉壁存在动脉粥样硬化斑块，提示动脉粥样硬化可能是TAD动脉壁HSP27表达减少的原因之一。

    　　HSP27也可参与细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导、调节氧化应激以及细胞骨架蛋白等，如应用药物诱导HSP27的表达可以减缓内膜增厚［8］。HSP27在VSMC的迁移和收缩所必需的肌动蛋白丝的重构中发挥重要作用，其可以增加氧化应激诱导的肌动蛋白断裂和细胞死亡的抵抗力，它的磷酸化形式能够结合并稳定肌动蛋白微丝，帮助肌动蛋白张力纤维的形成［9，10］。另外，HSP27 亦可防止热休克后肌动蛋白微丝碎裂，调节 F-actin 多聚化，影响细胞骨架及细胞迁移。研究显示，血液动力学应激可以增加血管SMC中HSP27的表达，急性高血压及血流动力学改变是其诱导合成的主要原因，这与 McGregor 等［11］证实的静脉 SMC 暴露于血液动力学应激时 HSP27 表达的变化相符。高血压是 TAD 常见的危险因素，因而将 HSP27 的表达强度与高血压进行相关分析，并未显示有明显相关。分析与其他因素的相关性包括年龄、直径、炎症反应及有无马凡综合征，均显示无明显相关，这可能与本实验的例数太少有重要关系，并不能排除存在其他可能性，需要今后较大样本的研究进一步证实。将 TAD 的炎症反应和急慢性病程进行相关分析，发现急性 TAD 较慢性的炎症反应明显，这可能提示炎症反应强与急性 TAD 破裂死亡率高有关系，值得进一步研究。另外，本实验发现 TAD 组夹层撕开处周围有一条形区域无 HSP27 阳性染色或染色明显减少，而该区域的 α 肌动蛋白染色也明显减少，这可能与该区域的 SMC 数量相对于其他区域明显减少有关，表明 HSP27 表达可能与 SMC 功能变化有关，同时也提示 HSP27 可能对肌动蛋白有影响，这与以往研究提示的 HSP 参与稳定细胞骨架蛋白相符。

    　　因此，本研究表明 HSP27 在 TAD 中的表达减少，其可能在 TAD 中具有重要作用，可能是通过参与主动脉壁的肌动蛋白细胞骨架， SMC 的增殖分化或凋亡等功能调控以及应激等因素来参与 TAD 的动脉壁重构过程，具体作用及作用机制有待于进一步的研究证实。

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作者：廖明芳　崔佳森　张健　王亮　刘延玲　包俊敏　景在平

作者单位：第二军医大学附属长海医院　血管外科　（上海　200433）