胸腺嘧啶核苷诱导肝癌HepG2细胞同步化

【关键词】  肝肿瘤;胸腺嘧啶核苷酸类

　　【摘要】 目的  探讨胸腺嘧啶核苷（TdR）诱导肝癌HepG2细胞同步化的方法。 方法  于对数生长期的HepG2细胞中加入含终浓度为2.5mmoL/L的TdR培养28h后，PBS洗除TdR，加入新鲜血清培养基，此时记为0时刻，分别继续培养0、2、3、4、5、6、7、8、9、12、18、24、28h，收集细胞，同时实验设立对照组，采用流式细胞术检测细胞周期。 结果  分别于去除TdR后培养4、8、24h获得78.1%的S期细胞、67.2%的G 2 /M期细胞、86.3%的G 1 期细胞。 结论  终浓度为2.5mmoL/L的TdR处理肝癌HepG2细胞28h，再以新鲜培养基培养不同时间，可以获得同步化效果较好的S、G 2 /M和G 1 期细胞。
    
　　【关键词】  肝肿瘤;胸腺嘧啶核苷酸类
         
　　Synchronization of HepG2cells induced by TdR

　　GAO Zhi-qing，HAI Chun-xu.

　　Department of Toxicology，Faculty of Preventive Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China
   
　　【Abstract】 ob[x]jective To study method of synchronization in HepG2cells induced by thymidine（TdR）.Methods After HepG2cells in the logarithm period were treated by2.5mmol/L TdR for28hours，the cells were washed twice using PBS to remove TdR and cultured for0，2，3，4，5，6，7，8，9，12，18，24h continually.Cells were collected and cell cycle was detected by flow cytometry.Control cells were compared in experiment.Results 78.1%S-phase cells，67.2%G 2 /M-phase cells and86.3%G 1 -phase cells were obtained respectively after cells were removed from TdR and cultured for4，8，24h continually.Conclusions Cells treated by2.5mmol/L TdR for28hours and then cultured for different time in fresh culture medium shows a good synchronization at G 1 -phase，S-phase，G 2 /M-phase.
   
　　【Key words】 Liver neoplasms;Thymine nucleotides
     
　　肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。肿瘤的发生发展与细胞周期失控有很大关系。无论是癌基因的激活还是抑癌基因的失活，终都作用于细胞周期的调控，表现在增殖过快，凋亡过少的失控性生长 ［1］ 。细胞周期与肿瘤发生理论上的重大突破，形成了对肿瘤治疗的新策略 ［2］ 。而且研究 ［3，4］ 表明，许多药物诱导肿瘤细胞凋亡的敏感性常依赖于细胞周期，所以选择肿瘤细胞作用敏感时期给予外源性化学物，对肿瘤细胞DNA进行“冲击”杀伤，可能会对抗癌治疗以及对肿瘤发生发展的防治机理研究提供新的思路。对于研究细胞周期与肿瘤的关系，细胞的同步化效果是非常重要的环节，本课题探讨了胸腺嘧啶核苷诱导肝癌HepG2细胞同步化的方法，为探讨肿瘤发生发展的机制以及提高肿瘤杀伤作用提供实验依据。
    
　　1 材料与方法
   
　　1.1 材料  RPMI-1640培养基（美国Gibco公司），TdR（Sigma公司），配制为浓度250mmol/L的母液，过滤分装，-20℃保存待用;小牛血清（杭州四季青生物公司）;流式细胞仪（FACSPLUS型），5%CO 2 培养箱（Forma）。

　　1.2 方法
    
　　1.2.1 细胞与细胞培养  肝癌细胞株HepG2由本校病理教研室惠赠。培养基为含10%的小牛血清及青霉素100KU/L，链霉素100KU/L的RPMI-1640培养基，37℃，5%CO 2 条件下培养。
    
　　1.2.2 胸腺嘧啶核苷诱导细胞同步化  取处于对数生长期的HepG2细胞，加入含终浓度为2.5mmol/L的TdR培养28h后，此时细胞被阻断在G 1 /S期，用PBS洗2次，去除TdR，记为0时刻，换新鲜培养基分别继续培养0、2、3、4、5、6、7、8、9、12、18、24、28h，收集细胞（1×10 6 /L），分离为单个细胞，离心（800rpm×5min），PBS洗2次，用1ml PBS使细胞重悬，边振荡边滴入预冷的固定液无水乙醇2ml，冷藏待用。
    
　　1.2.3 流式细胞测定技术检测细胞周期  上机检测前PBS洗去固定液，加入100μl PBS制成单细胞悬液后，RNaseA处理，用PI染色，并以流式细胞仪记录波长488nm处的红色荧光。
    
　　2 结果
    
　　用TdR处理细胞28h后，PBS洗除TdR，此时记为0时刻，细胞周期检测结果显示，G 1 +S期细胞达98%，换新鲜培养基继续培养，在前4h内S期细胞逐渐增多，4h时S期细胞达到78.1%，随后G 2 /M期细胞的比率逐渐增加，8h时G 2 /M期细胞达到67.2%，随后G 1 期细胞比率逐渐增加，24h时得到86.3%的G 1 期细胞，见图1。
    
　　3 讨论
    
　　体外培养细胞同步化方法有多种:短时间饥饿、照射、低温、药物抑制、机械振动收集分裂细胞等。TdR阻断法 ［5，6］ 是药物诱导同步化法中常采用的手段，在已往的报道中多采用TdR双阻断法。本实验充分考虑了细胞周期的因素，采用TdR一次性阻断法获得同步化细胞。HepG2细胞的细胞周期约为20～28h，因此，选择28h作为TdR的干预时间，理论上经过28h，所有处于不同细胞周期的细胞都可经历G 1 /S期的交界处，在TdR的作用下发生阻滞。在本实验中，分别获得了86.3%G 1 期细胞，78.1%的S期细胞和67.2%的G 2 /M期细胞，结果重复性良好，表明本法能够获得良好的同步化细胞。
   
　　研究表明，细胞周期失控的超常快速运行，将导致肿瘤的发生。肿瘤是环境因素和遗传因素的共同作用，导致细胞周期紊乱，细胞增殖失控，死亡抑制所致 ［7］ 。因此，肿瘤也可以说是一类细胞周期紊乱性疾病 ［8］ 。发现许多放化疗药物只对某一周期的细胞敏感 ［9，10］ 。因此细胞同步化也成为研究肿瘤的发生发展以及治疗的基础。
     
　　图1 不同细胞周期的细胞扫描图　略   

　　【参考文献】
    
　　［1］ Wang J，Zindy F，Chenivesse X，et al.Modification of cyclin A ex[x]pression by hepatitis B virus DNA integration in a hepatocellular carcinoma［J］.Oncogene，1992，7（8）:1653-1656.

    ［2］ Buolamwini JK.Cell cycle molecular targets in novel anticancer　drug discovery［J］.Curr Pharm Des，2000，6（4）:379-392.

    ［3］ Hsiang YH，Libou MG，Lui LF.Arrest of replication forks by　drug-stabilized topoisomerase I-DNA clearable complexes as a mechanism of cell killing by camptothecin ［J］.Cancer Res，1989，49（18）:5077-5082.

    ［4］ Lock RB，Ross WE.Possible role for p34cdc2kinase in etopo-side-induced cell death of Chinese hamster ovary cells［J］.Cancer Res，1990，50（12）:3767-3771.

    ［5］ Wang L，Chen L，Zhu L，et al.Regulatory volume decrease is actively modulated during the cell cycle ［J］.J Cell Physiol，2002，193（1）:110-119.

    ［6］ 叶飞，刘树铮.不同剂量X射线对同步化HeLaS3细胞周期的影响［J］. 中华放射医学与防护杂志 ，1999，19（6）:381-384.

　　［7］ Hoeijmakers JH.Genome maintenance mechanisms for preventing　cancer［J］.Nature，2001，411（6835）:366-374.

    ［8］ Culurman BE，Roberts JM.Cell cycle and cancer ［J］.J Natl Cancer Inst，1995，87（20）:1499-1501.

    ［9］ 程霜，郭长江.白藜芦醇抗肿瘤作用机制研究进展［J］. 疾病控制杂志 ，2005，9（3）:257-260.

    ［10］ Gorczyca W，Gong J，Ardelt B，et al.The cell cycle related dif-ferences in susceptibility of HL-60cells to apoptosis induced by various antitumor agents［J］.Cancer Res，1993，53（13）:3186-3192.

　　【作者单位】第四军医大学预防医学系毒理学教研室，陕西西安 710032

    【作者简介】高志清（1977-），女，山西翼城人，在读博士研究生。主要研究方向:细胞毒理学。

    【通讯作者】海春旭，Tel:029-84774879，E-mail:cx-hai@fm-mu.edu.cn。

作者：高志清，海春旭