RNA干扰Fas基因表达的免疫组化半定量分析

【摘要】  　　目的：探索图像分析技术在Fas蛋白表达检测中的作用。方法：用Image Pro Plus（IPP）软件图像半定量分析技术，判定RNA干扰抑制Fas基因后小鼠肝组织免疫组织化学染色切片和Western Blot检测的Fas蛋白表达情况。结果：RNA干扰有效抑制了Fas基因的表达，IPP图像分析方法显示，Fas蛋白表达在免疫组织化学染色切片的差异与Western Blot检测结果一致。结论：Image Pro Plus图像分析手段有利于通过半定量的方式判定Fas蛋白表达的变化。

【关键词】  RNA干扰 Fas蛋白 免疫组织化学 图像分析

　　Issue of Effects of RNAi Inhibited Fas ex[x]pression Via Semi Quantitative Analysis of

    Immunohistochemical Image

    Liu Mingshe, Zhao Zhongfu，Zhang Guoying, et al.

    Department of Parasitology, Changzhi Medical College

    Abstract  ob[x]jective:It is surveyed the effect of image analysis in detecting ex[x]pression of Fas protein.Methods：Image Pro Plus（IPP） was used as the method of semi-quantitative image analysis on immunohistochemical slide image and on Western Blot specific protein strip image, and evaluating the expressing protein of Fas gene inhibited by RNAi. Results:Statistical analysis showed that ex[x]pression of Fas gene effectively inhibited by RNAi.The result of semi quantitative image analysis on immunohistochemical slide image accorded with the result of on Western Blot specific protein strip image.Conclusion：Image Pro Plus is useful method in analyzing the immunohistochemical images of Fas protein ex[x]pression.

    Key words  RNA interference; Fas protein; Immunohistochemical; Image analysis

　   在检测基因表达的研究中，用免疫组织化学染色方法表明特异蛋白表达的细胞定位和染色程度来表明表达量的多少。虽然从图像上看到了基因不同表达的差异，但要进行统计学处理，就应当把表达结果数字化。我们在进行RNA干扰Fas基因表达的研究中，运用Image Pro Plus（IPP）软件分析了Fas蛋白表达免疫组化的实验结果，并与Western Blot方法进行比较。探索用半定量方法分析研究基因差异性表达。

    1  材料和方法

    1.1  RNA干扰LPS诱导的小鼠肝脏Fas基因的表达实验［１］

    1.2  实验动物分组和Fas基因表达检测

    20只BALB/c鼠随机分为RNA干扰组（RNAi组）、腺病毒通用阴性对照组（HK组）、模型组（M组）和正常对照组（N组）4个组，每组5只［１］。采用免疫组化方法检测肝脏组织Fas和Western Blot方法检测各组实验组鼠肝脏组织Fas蛋白的表达［１，２］。

    1.3  小鼠肝脏Fas蛋白表达的免疫组化数码图像

    实验鼠肝脏切片进行Fas蛋白表达的免疫组化染色。在保持显微镜下相同光强度、数码相机关掉自动白平衡等功能、全部用手动设置等条件下，拍摄400×数码照片，每张切片拍摄5个视野的照片。20只鼠肝脏免疫组化数码图像共100幅。选择640×480像素范围进行裁切图像。

    1.4  小鼠肝脏Fas蛋白表达的Western Blot检测结果数码图像

    对显色后的PVDF膜进行数码拍摄（拍摄条件同上, 保持所有PVDF膜像素一致），每个实验组拍摄5幅图像，共20幅。

    1.5  数码图像的IPP软件分析

    首先将IPP程序系统的灰度单位转换成光密度单位。免疫组化染色图像的分析，把图像中呈现黄色的区域（Fas蛋白染色）作为AOI（area of interest）进行光密度测定分析。选择测量area面积、density（mean）平均光密度和IOD（integrated optical density）累积光密度。Western Blot检测数码图像，以Fas和β-actin蛋白表达条带作为AOI进行IOD测定。

    1.6  统计分析

    用SPSS软件对Fas蛋白表达的IOD值进行方差分析和LSD检验。 Western Blot结果的分析，根据Fas蛋白表达的IOD与β-actin蛋白表达的IOD比值作为相对量进行统计学处理。

    2  结果

    2.1  小鼠肝脏Fas蛋白表达的免疫组化检测IPP图像分析结果

    各组实验鼠肝组织切片Fas表达免疫组化染色结果（见图1，表1）。图中照片示每组各一只鼠免疫组化数码图像之一。表1  IPP图像分析鼠肝组织Fas蛋白表达的免疫组化染色的IOD值免疫组化染色切片数码图像IOD值的统计分析显示，不同实验组间Fas蛋白表达差异具有显著性（ANOVA：F=557.48,P＜0.01）。M组与HK组之间Fas表达差异没有显著性（t=0.114,P=0.909），而M组和HK组与RNAi组之间Fas表达差异具有显著性（t=28.907和t=29.021，P＜0.01）。

    2.2  小鼠肝脏Fas蛋白表达的Western Blot检测IPP图像分析结果

    刘明社等.RNA干扰Fas基因表达的免疫组化半定量分析各组实验鼠肝组织Fas表达经Western Blot方法检测（见图2，表2）。表2  IPP图像分析鼠肝组织Western Blot检测Fas与β-actin蛋白表达的IOD比值 统计分析表明，不同处理组间Fas表达差异具有显著性（ANOVA：F=458.046,P＜0.01）。M组与HK组之间Fas表达差异没有显著性（t=0.820,P=0.4282），而M组和HK组与RNAi组之间Fas表达差异具有显著性（t=26.767和t=25.947，P＜0.01）。

    3  讨论

    RNA干扰方法作为基因敲除工具有效抑制基因表达，已经成为基因工程技术的重要手段，甚至可以作为疾病治疗的药物达到应用［３～5］。我们运用腺病毒载体把Fas-shRNA导入BALB/c鼠体内，有效抑制了内毒素LPS诱导的肝细胞Fas基因的过度表达。经过IPP图像处理技术，对Fas基因表达的免疫组化检测和Western Blot检测结果进行分析，结果均表明Fas蛋白表达在RNA干扰组和未干扰组之间存在统计学的显著差异性。

    IPP软件用于免疫组化结果的半定量分析方法在病理学诊断中有广泛的应用价值［6～8］，非常方便于图像资料的统计学分析。对Western Blot检测结果的分析也与免疫组化染色图像的分析一致，表明IPP的分析结果具有可靠运用价值。当然，正确的使用IPP软件还需要注意其对分析对象的适用性，条件设置不当，就会造成分析结果错误，如必须有一致的数码图像采集条件、一致的实验条件，以保证图像的来源前提条件相同，这样在后续的分析中才不会出现错误的结论。IPP软件的运用于分子生物学领域的研究，为图形图像的数字化分析带来极大的帮助。

【参考文献】
  　　［１］ 刘明社，赵中夫，王 兰，等．腺病毒载体shRNA抑制脂多糖诱导小鼠肝细胞的Fas表达［Ｊ］.中华肝脏病杂志,2007，15(6):475～476.

［２］ 刘明社，汪世平，赵中夫，等．腺病毒载体RNAi技术抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas表达［Ｊ］.中国人兽共患病学报,2007,23(4):358～361.

［3］ Bumcrot D, Manoharan M, Koteliansky V,et al.RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs［Ｊ］.Nat Chem Biol，2006，2:711～719.

［4］ Campochiaro PA. Potential applications for RNAi to probe pathogenesis and develop new treatments for ocular disorders［Ｊ］.Gene Ther，2006，13:559～562.

［5］ Reich SJ, Fosnot J, Kuroki A, et al.Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model［Ｊ］.Mol Vis，2003，9:210～216.

［6］ 申 洪, 陆药丹.免疫组织化学染色的定量方法研究［Ｊ］.生物医学工程学杂志,1993，10:281～284.

［7］ 申 洪.免疫组织化学显色反应强度定量方法研究(Ⅱ)［Ｊ］.细胞与分子免疫学杂志,1994，4:33～35.

［8］ 申 洪.免疫组化染色定量方法研究(Ⅲ)［Ｊ］.中国组织化学与细胞化学杂志,1995，4(1):89.

作者：刘明社 赵中夫* 张国英 张 芸 武延隽

作者单位：1 长治医学院人体寄生虫学教研室(046000) 2 长治医学院传染病学教研室 　基金项目 山西省自然基金资助项目(20051114)