法舒地尔可减轻野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压

         肺动脉高压是常见心血管疾病之一,其王要病理生理学特征是肺血_管阻力进行性升高,并逐渐引起右心衰竭甚至死亡,肺动脉高压具有病囚复杂、发病率高、误诊率高、危害性强的特征,早期诊断和药物治疗的机会丧失,多数患者会在2一3年内死于心力衰竭,因此这一疾病有"心血管系统的恶性肿瘤"之称二相关指南将肺动脉高‘作为了肺高血压疾病中除了肺静脉高压、混合性肺高压外的又一大类疾病几,尽管肺动脉高压肺血管形态改变已经比较明确,但是血管重构和血管反应性增加的机制仍然未完全阐明)对其发生机制的进一步理解将有一助于为预防和治疗肺动脉高)}于以及肺高血压提供临床依据.
Rho/Rlo激酶信号通路是体内普遍存在的一条信号通路,Rh.被称为小(}蛋自超家族,具有GTF酶活性、Rho激酶又称Rh.相关激酶(ROCK),属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.可与GTPRho相结合,是口前功能研究为洋细的Rh.下游靶效应分子,它包括2种亚型.即ROCK-1和POCK-2,其中ROCK-1在心8L卜肺脏、骨骼肌、’肾脏和胰表达水平很高4_法舒地尔是一种新型异峰琳磺胺衍生物,通过阻断Rh.激酶的活性,抑制肌球蛋白轩链激酶(TL等多个蛋白酶,进而抑制血管平滑肌收缩终阶段肌球蛋白轻链(M1,C)磷酸化,达到扩张血管的作用.
         本研究选择野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型,Rl,o激酶选择性抑制剂法舒地尔对肺动脉高床及肺朋曹重构进行书预治疗6,进一步探讨Bho/fLl1Ch洁号传导通路在肺动脉高压分子机制中的作用,以期为肺动脉高版的临床药物治疗提供理论和实验依据.
         材料与方法 
         1.实验动物:清洁级健康`}:n<}gue-Dawlea(SD)雄性大鼠5E1只.8周龄,}本质量300一350g(上海斯莱克实验动物有限责任公司).
         2.仪器:聚乙烯右心导管(中国医学科学院基础医学研究所)显微镜(Oly}mpusimt221,日本)EPS-601电泳仪(Phamacia公司,瑞典).半干电转仪TE70(}lmcrsham公司,瑞典丸垂直电泳槽SE?50(Hoofer公司,美国)BM-6240B/C多导电生理记录仪(h丈都仪器1})电子天平(BP310S型,德国)}DS-C1电泳仪系统、图像分析系统(}mer}hamPharmaci.公司,瑞典).
         3.试剂:野百合碱(}1g1Tla公司,美国)盐酸法舒地尔注射液(日本旭化成制药株式会社,进口药品注册证号:H20050331,产品批号:ERS11MM)小鼠抗人Bh.相关激酶-1单克隆抗体(SantaCruz公司,美国)、兔源MYP'1'-1多克隆抗体(CST公司,美国)兔源pM}'I'T-州Thr853)多克隆抗体(CST公司,美国)BT试齐d盒为(PromegaCorporation,美国)TBTzoI试剂(Invitrogen,美国).
         4.动物模型的建立、分组及其十预:健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后采用随机数字表法将其分为正常对照4周组(N4组,;;=8)、模型对照4周组(X14组,,,=8)、正常对照8周组(1}8组,,*=8)、模型对照8周组(1}M8组,,,=16)和法舒地尔8周组(F8组,n=16)5组肺动脉高压大鼠模型的建立将野百合碱济解于1mol/L稀盐酸溶液,以1mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH7.2,用生理盐水配制成1%溶液,一次性于大鼠头颈部皮下注身J‘野百合碱50m};/kg,4周后右心导管测压方法检测模刑是否建立成功,即M4组、4,18组皮下注射等体积生理盐水,普通饲料分笼喂养,自由饮水、进食V18组同期腹腔注射等体积生理盐水处理至第8周末F8组于造模成功后即第4周末开始腹腔注射法舒地尔15mg·k·d至第8周末.
         5.右心室收缩压(RV'SP)和平均肺动脉压(mPAP)的测定:于注射野百合碱后第4,8周末分别停药2d(即经过5个半衰期以土)然后以10plc水合氯醛30ml/k};腹腔内注射麻醉,参照孙波和刘文利7的右心导管测仄方法经右颈外静脉插管至右心室和肺动脉,肝素化后用多导电生理记录仪测定RVSP和mPAP.
         6.组织学观察:取大鼠心脏去心房及大血管,游离右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S),生理盐水冲洗掉血液,用滤纸吸去表面水分,分别用电子天平称重.并计算右心肥厚指数,即RV/(LV+s)迅速在相同部位取肺组织置于4仁C0.1r}二乙基焦磷酞胺(DEPC)水中,置人液氮中速冻备提取蛋白10%中性福尔马林溶液中固定48h,常规石蜡包埋,连续切片,备用于HE染色和免疫组化选取10个视野测定与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的直径75一150},m的肺小动脉管壁厚度占血管外径的百分比(}Tl`Tr}c)和管壁面积占血管总山积的百分比(WA}7c).
         7.免疫组织化学染色结果判断肺组织中的RocK-1蛋自表达:参照福州迈新生物技术开发有限公司免疫组织化学试剂盒说明书进行.用高压热修复方法,一抗浓度:小鼠抗人P}ocK-1单克隆抗体(稀释度1:100);何个视野测定一定而积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度,取均值后计算抗原阳}h}信号指数计算公式:阳性信号指数=信号面积X阳性信号平均灰度/测定面积Xloo_半定量的结果以阳性信号指数表.
         8.半定量逆转录一聚合酶链反应(PST-PC1刊检测肺组织ROCK-1mRNA表达:参照逆转录试剂盒(Promega公司,美国)说明书进行,cDNA链合成,反应条件为95℃预变性5min,94℃变性30s.52℃退火40s,72℃延伸30s,后72℃延伸7min,共30个循环二引物合成由上海生工生物技术有限公司完成Pock-1引物序列:扩增产物大小为201by,上游引物5'-GGAAACGCTCC(;:A(;AC;ACTG-3',下游引物5'-CTGCGATTTGCTGA:1GGT_1AG-3’内参照GAPDH引物序列:打一增产物大小为131帅.上游引物5'-GT(:CATGCCAT(:
         A(:TGC(::\C-3',下游引物5'-ATGACCTTGCCCACAGCCTT-3’各取PCR产物5闪,经1.50}c琼脂糖凝胶电泳,澳化乙锭染色,应用Tmagenrastery)SCI.对凝胶成像,计算PCR产物电泳条带灰度积分,并以(}APDH的灰度积分进行标准校对口标墓因P(}R产物的相对量=口标墓因电泳条带灰度积分/GAPDH电冰条'}I}灰度积分.
         9.大鼠肺组织胞浆蛋白质提取及免疫印迹(V一estcrnblot)半定量分析检测ROCK-1,MYPT-1及pMYPT-I蛋白表达:肺组织胞浆蛋白的提取,按南京凯基抽提试剂盒说明书操作,Bradford法进行定量,SDI-PAGF电泳,P\DF车专膜,一抗用TBST封闭脱色摇床后进行化学发光反应_化学发光,显影,定影,将胶片进行拍照,显影图像采用Bandscan生物医学软件分析处理,检测ROCK-l(160000)和内参p-actin(43000),M}"PT-1(140000)和pMYPT-1(160000)口标带的灰度值,分别以二者比值作半定量分析.
         10.统计学分析:采用SPSS17.0软件进行统计分析计量资料用x1、表示,符合正态分布的资料多组间均数比较采用方差分析,组间两两比较用LsD(方差齐)或Dunnett'sT3(方差不齐)法进行显著性检验以P<0.O5为差异有统计学意义.
         结果
         1.各组大鼠的一般情况分析:实验大鼠于注射野百合碱后第3周末逐渐出现进食量减少,体质量下降,毛发枯糙,活动减少,喘C}C.、声明显等症状,至第8周末史为严重,甚至出现了严重右心衰竭和死亡F8组大鼠一般情况明显优于M8组,死亡动物比例亦较低二实验结束时,56只SI>大鼠中41只存活,其中\4组、1}}T4组和N8组每组的8只大鼠均存活,}}T8组存活5只(5/16),h8组存活12只(12/16)(图1)实验开始后第4,8周末测压后处死大鼠,}T4和1}R8组大鼠可见心包积液,偶见胸腔、腹腔积液,出现肝脏癖血点、月十肿大,肺部组织(尤其左肺中、下叶)可见肺部癖斑、癖血,出现肺水肿和纤维样变.
         2.各组大鼠血液动力学指标及右心肥厚指数检测结果(表1);野百合碱注射后4周末`14组大鼠RVSP,mPAP显著高于N4组(P均<0.O1),示肺动脉高压模型建立成功实验开始第4周末,M4组大鼠RV/(LV+S)显著高于N4组(P<0.O5)一实验开始第8周末,V18组大鼠R}SP,mP-1P,liV(L}'+S)均进一步高于114组(P均<0.05)F8组大鼠RVSP,mPAP虽仍高于\8组水平(P均<0.O5),但均显著低于M8组(P均<0.O5),F8组大鼠PTV/(LV十S)亦显著低于M8组(P<0.05,且与N8组比较差异无统计学意义.
         3.各组大鼠肺小动脉形态学观察结果(表2):N4组、}r8组大鼠肺小动脉血管内皮细胞连续,分布均匀,大小厚薄较一致,血管壁无增厚,血管腔无狭窄至实验开始第4周末M4组大鼠肺小动脉内皮细胞连续性差,层平滑肌细胞肥大、排列紊乱,血管腔明显狭窄,T%和A%均明显高于1V'4组(P均<0.05),M8组则进一步高于M4组(P<0.01)F8组大鼠病变较轻,U;,T%和VA%均明显低于'VI8组(P均<0.O1).
         4.各组大鼠肺组织中ROCK-1蛋白表达水平的免疫组织化学检测结果(图2);ROCK-1阳性表达产物以棕色反应物为表现,棕色反应物广泛位于肺动脉血管内皮细胞和一些支气管及肺泡上皮细胞实验开始第4周末.M4组大鼠肺组织中ROCK-1蛋日表达水平({扫性信号指数:17.51士0.2W明显0于\4组(阳性信号指数:7.24士0.13)(P<0.01>提T经野百合碱诱导后的大鼠肺动脉高压模型成功建立.同样,实验开始第8周末,M8组大鼠肺组织中ROCK-1蛋白表达水平(阳性信号指数:20.68士0.27)亦明显高于N8组(阳性信号指数:8.1910.09)(P<0.01),且'}M8组进一步高于}I4组(P<0.05)法舒地尔治疗4周后,F8组大鼠肺组织中ROCK-1蛋白表达水平(阳性信号指数:12.35士0.08)明显低于M8组(P<0.01),但仍较\8组高(P<0.O5).
        

         5.各组大鼠肺组织中R(>(:K-1mRNA表达的RT-P(:R检测结果:实验开始第4,8周末,\}4组和N8组大鼠肺组织中ROCK-1mRNA表达较少(RT-PCR的相对一表达量分别为1.1081士0.2011和1.070810.1931),M4组(RT-PCR的相对表达量为1.6132士0.1541)则显著高于V'4组(P<0.01).F8组大鼠肺组织中ROCK-1mRNA的表达水平(RT_PCR相对量为1.2139士0.1778)显著低于M8组(RT-PCR相对量为1.6839士0.3251)(P<0.01).
         6.各组大鼠肺组织中ROCK-1蛋白表达水平及M}'P1'-1蛋白磷酸化程度的Westernblot检测结果(图3,4,表3):灰度分析结果TM4组和M8组大鼠肺组织中ROCK-1蛋白表达水平均明显高于N4组(P均<0.01),M4组与M8组间差异尤统计学意义.F8组大鼠肺组织中hocT<-}蛋白表达水平则明显低于M8组(P<0.01),但仍较118组高(P<0.O5卜M14,M8组大鼠肺组织中RMYPT-1蛋白磷酸化程度明显高于N4组(P<0.01),M8组与I}'T4组间比较差异无统计学意义,F8组MYPT-1蛋白磷酸化程度则明显低于M4和1}}18组(P均<0.01,但仍高于N8}N.(p<0.05).
         讨论
         有研究发现野百合碱可引起肺血管内膜损伤及肺血管重构,而形成肺动脉高压,与人类肺动脉高不的发病过程中,血管收缩、舒张因子失衡,血管收缩及个同程度肺血管亚构和肺而_管阻力增加的病理机制相似,故野百合碱引起的肺动脉高压大鼠是一种较为理想和市用的动物模},}-y-io+_本实验验证了此结沦,本实验结果显不子以大鼠皮下一次性注身J一野百合碱(50mg/kg),3周后大鼠出现体质量增{封y、毛发色泽灰暗、喘L.、声粗等表现,4周后即可弓{起典型的肺动咏高压表现为RVSP,mPr'P显著升高,继发右心室肥厚,至第8周末R}'SP,mPAP进一步升高,目_有淬死发生.解剂后发现胸腔、腹腔甚至心包积液,肝癖血,肺癖点、癖斑,短轴横切心脏发现右心室肥厚明显,提示实验大鼠发生右心衰竭二我们认为一次性注射野百合碱(50mg/k幻诱导4周的大鼠是一种敏感性高、生存率高、成本低、重复性好的肺功脉高压动物模型本研究发现,野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠R()(二K一]蛋}}I表达明显增多,且多于肺动脉内皮细胞上表达,肺小动脉内膜明显增生,血管中膜明显增厚,管腔狭窄,而法舒地尔治疗可使模型大鼠ROCK-1蛋白表达水平下降,明显降低RVSP,mP_}1P及减轩右心室肥厚肺动脉高压形成过程中,Rho/Rl-,o激酶通路的激活与肺血管的收缩和重构关系密切Rho/ROCK信号通路的关键分子包括Rho,GTP酶,Rh.相关激酶(ROCK)和肌球蛋自磷酸酶等当Rh<,蛋白与GTP结合时呈激话状态,从而发生多个氨基酸位点磷酸化而激活,并介导下游一系列磷酸化/月兑磷酸化反应,引起细胞收缩、游走私附、生长分裂、应力纤维产生及平滑肌运动、胶原合成等生物效应.
         本研究观察了法舒地尔对肺动脉高压大鼠Rho/ROCK信号传导通路的影响,结果显示大鼠肺组织中ROCK-1蛋I}1表达水平在野百合碱诱导后4周即明显升高,提示ROCK-1在肺动脉高形成过程中具有重要作用法舒地尔能通过抑制RO(:K-1活睦,平衡内皮细胞合成分泌L;'T'-1,}O水平,从而增强内皮介导的血管重构效应,改善肺动脉高)f症状肺动脉平滑肌细胞(PASYIC)表型由收缩烈同合成型转变、增生和肥大是肺血管重构的主要病理特征,同时伴有远端非肌性11ii_管肌化渊节bMI,C的磷酸化和去磷酸化是ROCK调节平滑肌细胞收缩的主要机制M1,C被钙调蛋白激活的MI,CK磷酸化,被不依赖Ca-+的MT.CP去磷酸化_MLCP是口前研究得多也是清楚的Rho激酶作用的底物之一’3-3m_ROCK的激活,d一以进一步磷酸化MYPT-1(MLCP的调节亚单位),抑制MT,CP的活性细胞浆内Ca-+浓度的升高通过激活M上CK和随后的11}1T.C磷酸化引起平滑肌细抱收缩因此.
         MYPT-1磷酸化水平还可以反映P}}}IC日训‘(缩程度5」P;W-TC的收缩、重构,使肺动脉!}一力上升、石心室后负荷过重,可导致右心室肥厚,甚至右心衰竭和死亡因此,法舒地尔可通过抑制ROCK-1活性,改善肺血管重构及缓解平滑肌细胞收缩,从而减轻野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压本研究观察了Rho/ROCK信号传导通路在师动脉高压形成中的表达与激活规律进一步探讨了Rho激酶卜游信号分子—MYPT-1蛋白磷酸化程度的改变对肺动脉血管收缩的影响本研究发现法舒地尔能有效地抑制ROCK-1活性,降低肺动脉压力,改善肺血管持续收缩,为肺动脉高压的药物治疗提供了新的研究方}句当前,Rho/ROCK信号传导通路及其上下游信号分子的纵向研究已成为肺动脉高压发病机制的研究热}'a,而此通路的!_下游信号之间是否存在横同的相互调节、反馈,可能会成为今后肺动脉高压发病机制的研究方向之一.
         参考文献 
         Humbert M,Sitbon O,Simonneau G. Treatment of pulmonary arterial hypertension[J].New England Journal of Medicine,2004.1425-1436.
         Gaine SP,Rubin LJ. Primary pulmonary hypertension[J].The Lancet,1998.719-725.
         荆志成. 2010年中国肺高血压诊治指南[J].中国医学前沿杂志(电子版),2011,(2):62-81.doi:10.3969/j.issn.1674-7372.2011.02.016.
         Higashi M,Shimokawa H,Hattori T. Long-term inhibition of Rho-kinase suppresses angiotensin Ⅱ-induced cardiovascular hypertrophy in rats in vivo:effect on endothelial NAD (P) H oxidase system[J].Circulation Research,2003.767-775.
         Liu XR,Zhang MF,Yang N. Enhanced store-operated Ca2 + entry and TRPC channel ex[x]pression in pulnonary arteries of monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats[J].American Journal of Physiology-Cell Physiology,2012.C77-C87.
         Mouchaers KT,Schalij I,de Boer MA. Fasudil reduces monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension:comparison with bosentan and sildenafil[J].European Respiratory Journal,2010.800-807.
         孙波,刘文利. 右心导管测定大鼠肺动脉高压的实验方法[J].中国医学科学院学报,1984.465-466.
         Abe K,Shimokawa H,Morikawa K. Long-term treatment with a Rho-kinase inhibitor improves monocrotaline-induced fatal pulmonary hypertension in rats[J].Circulation Research,2004.385-393.
         Shi J,Zhang YW,Summers LJ. Disruption of ROCK1 gene attenuates cardiac dilation and improves contractile function in pathological cardiac hypertrophy[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2008.551-560.
Vallerie V,Mclaughlin,Michael D. Pulmonary arterial hypertension[J].Circulation,2006.1417-1431.