牛黄酸和VC对染砷小鼠脑神经损伤保护作用

作者：朴丰源，杨光，李秋娟，叶建新，孙鲜策，马宁

作者单位：1.大连医科大学卫生学教研室，大连 116044； 2.日本国立三重大学医学部

【摘要】  目的 观察牛黄酸和维生素C(VC)对砷暴露导致的脑组织核酸损伤的保护作用，为砷毒性脑损伤的预防和治疗提供科学依据。方法 昆明种小鼠40只，随机分为4组：4?mg/L三氧化二砷染毒组、150?mg/kg牛黄酸和45?mg/kg VC拮抗组以及生理盐水对照组。每周2次，连续染毒60d，取小鼠脑组织固定，用免疫组化方法观察脑组织神经细胞8硝基鸟嘌呤(8-NO2-G)的表达。结果 染砷组小鼠脑组织出现异常病理学改变，脑皮质神经细胞的胞浆中8-NO2-G呈现明显的高表达。而牛黄酸和VC拮抗组小鼠脑组织出现轻度的病理学变化8-NO2-G表达。结论 牛黄酸和VC对砷暴露小鼠脑组织RNA损伤具有保护作用。

【关键词】  三氧化二砷；脑；8硝基鸟嘌呤；免疫组化；拮抗剂

　　Protection of taurine and vitamin C on damage of brain nerve in mice exposed to arsenic

　　PIAO Fengyuan，YANG Guang,LI Qiujuan,et al.

　　Department of Hygiene,Dalian Medical University(Dalian 116027,China)

    Abstract： ob[x]jective  To observe prerention of taurine and vitamin C from RNA damage of cerebral neurons in mice exposed to arsenic.Methods  Forty mice were divided into 4 groups,one control and one experimental group receiving As2O3,two antagonistic groups receiving taurine with As2O3 or vitamin C with As2O3,were administered for 60 days.Immunohistochemistry method was used to investigate 8nitroguanine ex[x]pression in cerebral neurons of mice.Results  The pathological changes and stronger ex[x]pression of 8nitroguanine were observed in the brain cortex of mice exposed to arsenic.In the two antagonistic groups,the light pathological changes and exprexssion of 8nitroguanine were shown in brain tissue of mice.Conclusion  Taurine and vitamin C may have the preventive effect on RNA damage of cerebral neurons in mice exposed to arsenic.

    Key words： As2O3；brain;8nitroguanine;immunohistochemistry;antagonistic agent

　　动物实验表明，砷可以通过血脑屏障进入脑实质，慢性砷暴露的豚鼠和大鼠脑中砷浓度与暴露呈显著正相关〔1〕。Chaudhuri等研究发现，即使砷在饮用水卫生标准浓度范围内，也能影响体内氧化还原平衡，增高脑脂质过氧化水平，降低谷胱甘肽(GSH)浓度和抗氧化酶活性，使脑组织受到自由基损害，引起神经细胞异常凋亡〔2〕。但是，砷诱发的神经系统损伤机制尚不十分清楚。目前认为，砷暴露使机体产生过量的活性氧族(ROS)和活性氮族(RNS)，导致机体组织细胞的核酸等生物大分子损伤是砷中毒的重要机制之一〔3〕。本研究以小鼠为研究对象，以8硝基鸟嘌呤(8Nitroguanine)作为砷毒性作用导致的核酸损伤标志物，以维生素C(VC)和牛磺酸作为拮抗剂，通过免疫组化方法，观察拮抗剂对砷暴露导致的脑组织核酸损伤的保护作用，为砷毒性脑损伤的预防和治疗提供科学依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　(1)As2O3(美国Sigma公司)；VC(沈阳新兴试剂厂)；牛黄酸(北京奥博星生物技术责任有限公司)；抗8Nitroguanine(8NO2G)单克隆抗体(德国Bremen公司)；Ultra SensitiveTMSP超敏试剂盒、二氨基连本氨(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；其他试剂均为分析纯；(2)主要仪器：石蜡切片机(YD1508B，浙江省金华市益迪医疗设备厂)；BX51万用光学显微镜(日本Olypus公司)；DC290数码相机(日本Kodak公司)；分析处理系统(Imagepro plus 4.5)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物处理

　　成熟健康昆明种小鼠40只，雌雄各半(大连医科大学实验动物中心)。按体重随机分为4组(每组10只)：4?mg/L的三氧化二砷(As2O3)染毒组；45mg/kg VC和150?mg/kg牛磺酸的2个拮抗剂干预组；生理盐水对照组。前3组通过自然饮用含As2O3自来水方染毒，拮抗剂是以灌胃方式投给，每周2次。每天测体重和水消耗量。连续染毒60?d，处死小鼠后立即取脑组织固定。

　　1.2.2  脑组织形态学观察

　　脑组织经福尔马林固定后，常规石蜡包埋，5?μm连续切片，在65℃温箱中烤片60?min;苏木素伊红(HE)染色，光镜下进行组织形态学观察。

　　1.2.3  脑组织免疫组织化学观察

　　按照S-P免疫组化染色法〔4〕，在脑组织切片上滴1：300稀释的鼠抗人8NO2G单克隆抗体，在4℃条件下孵育过夜，然后按Ultra SensitiveTMS-P超敏试剂盒的步骤进行(DAB)显色，苏木素复染细胞核，自来水冲洗返蓝。常规脱水、透明，中性树胶封片。阅片时，先观察整张切片，再随机选择不同区域的5个高倍视野，并拍照，并应用图像分析软件对8NO2G表达的平均吸光度值进行定量的分析。

　　1.3  统计分析

　　用Scheff′s test 方法进行组间均数比较，以P<0.05表示差异有统计学意义。采用SPSS 11.5软件进行统计分析。

　　2  结  果

　　2.1  脑组织病理学观察(图1)  光镜观察结果显示，对照组小鼠脑神经细胞未见异常病理变化，染砷组小鼠脑神经细胞出现肿胀，胞浆和胞核内有空泡变性，核碎裂、核质溶解等明显的病理学改变。而在拮抗组小鼠的脑神经细胞中上述病理变化不明显。

　　2.2  脑组织核酸损伤的免疫组织化学观察(图2，表1) 表1  各组小鼠脑神经细胞抗8NO2G免疫染色平均光密度值(略) 注：a 含有4?mg/L As2O3的自来水自然饮用，150?mg/kg牛磺酸和45?mg/kg VC组每周灌胃2次，持续60?d。与对照组比较，b P<0.05,c P<0.01；与牛磺酸干预组比较，d P<0.05,与VC干预组比较，e P<0.05。

　　采用标记的链菌素亲生物蛋白(LSAB)免疫组化方法检测小鼠脑组织8NO2G的表达水平。对照组小鼠脑组织神经细胞中几乎无8NO2G的表达，染砷组小鼠脑组织神经细胞中靠近细胞膜的胞浆被染成棕褐色，呈现明显的抗8NO2G阳性反应，而牛黄酸和VC拮抗组小鼠脑组织神经细胞中只有轻度的8NO2G的表达。各组小鼠脑神经细胞的抗8NO2G免疫染色平均光密度值，实验组小鼠脑神经细胞的抗8NO2G免疫染色平均光度密值明显大于对照组和2个拮抗组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

　　3  讨  论

    8NO2G是由活性氮族，过氧亚硝酸阴离子或二氧化氮攻击核酸的产物，可进一步导致突变、癌变的发生。Ma等曾报道胃炎病人的胃粘膜上皮中有8NO2G表达，并认为8NO2G不仅是炎症的标志物，还是一种判断是否癌变倾向的指示物〔5〕。本实验结果显示，慢性砷暴露的小鼠脑皮质中有8NO2G的高表达，说明砷暴露可以导致脑的核酸损伤。而且，8NO2G的表达主要集中在靠近细胞膜的胞浆中。 由于8NO2G在DNA的结构中进行迅速的脱嘌呤反应，它在RNA中要比在DNA更为稳定〔6〕，说明砷暴露小鼠脑组织8NO2G的高表达可能主要与砷致神经细胞RNA损伤有关。作者曾经报道过砷引起小鼠脑皮质神经元的氧化性DNA损伤〔7〕。实验结果提示，砷可能通过ROS引起DNA的氧化损伤，而通过RNS则主要引起RNA损伤。同时也提示，脑皮质神经元可能是砷的神经毒性作用的主要靶细胞。

    牛黄酸是机体的内源性抗损伤物质，可清除几乎所有的自由基和活性氧。水溶性VC是重要的细胞外液抗氧化物，且在细胞内液也有重要的抗氧化性能，能有效消除氧自由基〔8〕。本实验结果表明，投给牛磺酸和VC的小鼠脑组织的病理变化相对较轻，而且脑皮质中8NO2G的表达也比砷暴露组少。结果提示，牛磺酸和VC对砷诱导的RNS致脑组织神经细胞RNA损伤也具有一定的保护作用。其作用机制可能与牛磺酸和VC通过减少氧自由基，阻止NO与氧自由基等反应而生成过多的过氧亚硝基阴离子有关。

【参考文献】
  　　〔1〕Rogdrguez VM.Effects of sodium arsenic exposure on behavioral parameters in the rats［J］.Brain Res Bull,2001,15:301-308.

　　〔2〕Chaudburi AN,Basu S,Chattopadhyay S,et al.Effect of high arsenic content in drinking water on rat brain［J］.Indian J Biochem in Biophys,1999,36:51-54.

　　〔3〕李友.砷中毒机制研究进展［J］.国外医学卫生学分册，2001，5：261-265.

　　〔4〕Somchai pinlaor,Puangrat Yongvanit,Yusuke Hiraku,et al.8nitroguanine formation in the liver of hamsters infected with opisthorchis viverrin［J］.J Biophys Res Commun,2003,309(3):567-571

　　〔5〕Ning Ma,Yukihiko Adachi,Yusuke Hiraku,et al.Accumulation of 8nitroguanine in human gastric epithelium induced by helicobacter pylori infection［J］.Biochem Biophys Res Commun,2004,319(2):506-510

　　〔6〕Ratnaike RN.Acute and chronic arsenic toxicity ［J］.Postgrad Med J,2003,79:391-396.

　　〔7〕Fengyuan Piao,Ning Ma,Yusuke Hirakeu,et al.Oxidative DNA damage in relation to neurotoxicity in the brain of mice exposed to arsenic at environmental relevant levels［J］.J Occup Health,2005,47(5):445-449.

　　〔8〕Padayatty SJ,Katz A,Wang Y,et al.Vitamin C as an anioxidant of its role in disease prevention［J］.J Am College Nutr,2003,22:18-35.