组织工程技术修复骨缺损的研究现状及进展

作者：吴雪晖，罗飞，谢肇，许建中

作者单位：第三军医大学西南医院骨科，全军矫形外科中心，重庆400038

【摘要】  骨缺损的治疗是困扰骨科临床的难点，传统的治疗方法极为困难。随着组织工程学的迅速发展，通过对种子细胞进行基因修饰、构建复合支架材料及促进组织工程骨早期血管化等方法，使应用组织工程技术治疗骨缺损成为目前研究的热点，作者对其研究现状及进展进行了综述。

【关键词】  组织工程；骨缺损

基金项目：国家高技术研究发展计划资助重大攻关课题  （2006AA02A122）
　　Advances of repair of bone defect with tissue engineering technique
   
　　WU Xuehui,LUO Fei,XIE Zhao,et al.

    (Orthopedic Center of PLA,Department of Othopaedics,Southwest Hospital,Third Military Medical University, Chongqing400038,China)

    Abstract:The treatment for bone defect is difficult in orthopaedics clinic, and it is hard for traditional methods.With the rapid development of tissue engineering technique,repair of bone defect with tissue engineering has been the hotspot,such us gene modification of seed cells,construction of composite scaffold and promoting earlyperiod vascularization of tissue engineered bone etc.The author gives an overview to current situation and advances for its research.

    Key words:tissue engineering;bone defect

    骨缺损、特别是大段骨缺损常因创伤、感染、肿瘤、骨不连多次手术植骨内固定失败及先天性畸形所致，传统的治疗方法极为困难。终很多病例不得不采用截肢术或用支具保护性负重。近年来，随着分子生物学研究的深入及组织工程学的迅速发展，使应用生长因子和骨组织工程技术治疗骨缺损成为目前研究的热点［1］。其主要研究内容包括种子细胞的选择与培养、支架材料的选择与修饰及组织工程化组织的构建等［2］。本文就种子细胞、支架材料、生长因子的特点与作用及组织工程骨的血管化作一综述。

    1种子细胞(seeding cells)

    理想的骨组织工程种子细胞应该是具有成骨能力的细胞，其特点为：(1)细胞来源可靠，取材方便，对机体损伤小；(2)在体外培养体系中具有较强的增殖传代能力，生物活性好，能够在较短时间内得到较多数量并易定向分化为成骨细胞；(3)植入机体后能适应受区环境，保持高质量成骨活性，且远期效果良好；(4)生物毒性低，组织相容性好，免疫活性低，致瘤性低［3］。

    1.1骨与骨膜来源的成骨细胞(osteoblast)成骨细胞有良好的成骨能力，但取材困难、创伤大，来源有限，而且为成熟细胞，扩增能力有限，因此难以满足大节段骨缺损对种子细胞的数量需求［4］。

    1.2胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES)属于全能干细胞，具有无限增殖能力，从理论上可作为骨组织工程佳的种子细胞来源，但目前研究多停留在细胞建系上，对其诱导分化的研究还不够深入，且由于伦理上的原因，从现阶段来看，ES真正能够用于骨组织工程还不太现实［5］。

    1.3成体干细胞(adult stem cells)在相当长的一段时间内，组织中的成体干细胞被认为仅能定向分化为特定的细胞系，即其所处组织的成熟细胞。近年来有学者已从皮肤、脂肪、肌肉等骨外组织中分离出能够向成骨细胞分化的干细胞，但必须在诱导因子的作用下才能完成［6］，因而限制了其在骨组织工程中的应用。

    1.4骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)BMSCs具有高度增殖、自我更新能力，可在不同诱导条件下分化为软骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪、真皮、神经等，以骨髓中的含量为丰富。大量实验表明，BMSCs经成骨诱导后再复合适当的支架材料，能够异位成骨、修复骨缺损，是目前具有应用前景的种子细胞［7］。但在骨髓中，BMSCs含量极少，作为种子细胞，必须达到一定的的密度才能保证其体内成骨，因而必须对其进行分离和大量扩增才能满足需要。

    1.5种子细胞的体外大规模扩增在体外短期内获得充足的种子细胞，是组织工程骨产品产业化的关键性制约因素，目前所应用的常规二维培养系统无法满足需要。研究人员已构建了多种能提供微载体大规模扩增的生物反应器系统，如：模拟微重力旋转生物反应器、固体转动旋转生物反应器、搅动混合旋转培养瓶、环绕混合培养皿和灌注培养系统等［8］。同时通过三维立体的培养方法，使细胞在材料孔隙的各个面上均能生长，更适合骨组织工程的要求。

    2支架材料(scaffold)

    目前，用于骨组织工程的细胞支架材料有两大类，一类为人工合成细胞支架材料，另一类为天然细胞支架材料。

    2.1人工合成细胞支架材料分无机材料与有机高分子材料两类，无机材料包括多孔羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic，BGC)等。它们虽有较好的生物相容性，但其塑形难、脆性大、降解时间长、表面活性较差，应用受到了很大限制。自固化磷酸骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)可以注射入体内并自行硬化，对所需填充部位做到充分填充，不留空隙，是近年来新出现的合成材料，为骨组织工程学者所关注［9］。有机高分子材料中聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)及其共聚物(PLGA)应用为广泛。尽管它们有良好的生物相容性、可吸收性、材料的吸收率可以通过共聚单位的相关比例来控制等优点，但仍存在着费用昂贵、降解率低、机械强度较差、可塑性不强及降解后产物会改变周围环境pH值、导致纤维化甚至诱发免疫反应等缺点。

    2.2天然细胞支架材料天然细胞支架材料有4种：（1）珊瑚：Petite等［10］以珊瑚为支架材料，用自体骨髓基质干细胞为种子细胞，构建了组织工程化跎骨，成功修复了羊跎骨25mm的骨缺损。（2）胶原：骨组织中主要为Ⅰ型胶原。它虽然因含特定的细胞识别信号而利于成骨细胞增殖分化，但由于缺乏一定的机械强度，难以单独用作成骨细胞培养基质材料。（3）甲壳素：甲壳素是一种天然高分子多糖，由于其本身安全无毒、可降解、生物相容性好，作为组织工程中细胞培养的支架材料有着广阔的前景。（4）脱钙骨基质(decalcified bone matrix，DBM)：同种异体DBM具有极低的免疫原性、良好的细胞及组织相容性及消毒后保持其骨诱导能力的特性，本身亦具有一定力学强度，通过改变脱钙率可以调节其力学强度，以适应临床不同植骨部位的需要［11，12］。通过采集前病原学检测和相应的加工处理，可以保证其具有较好的生物安全性。

    2.3复合支架材料为克服以上支架单独使用的不足，许多学者将几种材料按一定比例复合后用于骨修复，如HA与TCP、HA与胶原、HA与PLGA复合等，复合材料不但能保证足够的强度而且能有效地结合种子细胞和生长因子，有利于组织工程骨的构建［13］。另外，利用纳米技术制备有机/无机复合材料，并将生长因子、基因等特定分子识别信号固定在材料表面，对其进行分子设计和生物化处理，研制成新一代有特定结构和功能的仿生“智能”基质材料是当今组织工程学和生物材料学研究领域的前沿课题［14］。

    3生长因子(growth factor)

    生长因子可对细胞分裂、基质合成和组织分化等重要功能发挥调节作用。在骨创伤早期，生长因子主要通过自分泌和旁分泌作用刺激成骨细胞前体分化增殖，激活成骨细胞活性，促进成骨。后期作用逐渐减弱，但也参与骨的生长调节。

    3.1骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)目前已测出16种BMP的序列，其中重组人的BMP-2、BMP-8均具有高效的骨诱导能力，能够促进未分化的间充质细胞和成骨细胞的前体细胞分化为成骨细胞，引导成骨细胞表型的表达，增加骨胶原的合成，在骨形成中起着重要作用，因而成为研究和应用为广泛的生长因子［15］。

    3.2胰岛素样生长因子(insulinlike growth factor，ILGF)ILGF是一类结构上类似于胰岛素原的多肽，它能促进成骨细胞的增殖和基质合成，具有刺激骨缺损修复的作用。

    3.3成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)FGF由成骨细胞产生，能刺激成骨细胞内的DNA合成，使成骨细胞内骨钙素增加，加速骨的钙化，使新骨形成。

    3.4血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)PDGF既可刺激软骨细胞和成骨细胞的增殖、分化，又可调节破骨细胞的骨吸收，并可间接地诱导血管内皮细胞增殖与血管发生。PDGF还可促进创伤局部组织的连接，增加胶原合成和增加局部应力。

    3.5血管内皮生长因子(ascular endothelial growth factoer，VEGF)VEGF作为一种特异性促血管内皮细胞增生及血管生成因子，对正常生理及病理过程中的血管再生起着关键性作用。

    3.6β转化生长因子(transforming growth factorβ，TGFβ)TGFβ在成骨细胞中合成并作用于成骨细胞，调节其增殖和分化，促进成骨和成软骨细胞增生，刺激Ⅰ型胶原合成，诱导膜内成骨及软骨内成骨过程。

    4组织工程骨(tissue engineering bone，TEB)的血管化
   
　　研究证明，用组织工程骨修复骨缺损时，其早期成骨及后期骨愈合效果明显。但应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，主要原因就在于未能很好解决组织工程骨的早期血管化问题［16］。

    目前的主要方法有：

    4.1血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)与成骨细胞(osteoblast)或血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)加生物材料联合移植。此方法需要大量培养、扩增血管内皮细胞。细胞体外培养的要求很高，周期长，规模扩增相当困难。且成熟血管内皮细胞的成血管作用较弱［17］。

    4.2应用显微外科技术将成骨细胞、生物材料及带血管蒂的组织瓣包埋或血管束植入重建组织工程骨血运。此方法能够得到血管化的组织工程骨，但必须将其异位植入，待血管束长入后再断蒂用于移植，不但有异位创伤的问题，而且等待的时间也较长［18］。

    4.3利用VEGF、血管生成素(angiopoletin，Ang)等与生物材料复合促进血管生长。促血管生长因子直接应用在体内会迅速降解为无活性的片段，达不到理想的效应浓度；而采用大剂量给药又易导致局部血管瘤。因此有学者［19］将各种促血管生长因子的基因通过转染技术，使其在种子细胞内表达，再将这种转染细胞种植于支架材料表面构建组织工程骨后植于骨缺损部位，这是组织工程骨血管化的主要研究方向之一。存在的主要问题是如何提高转染率，使细胞高效表达，以及细胞的安全性和免疫问题。

    4.4利用血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管新生中的促血管生成作用促进组织工程骨的血管化。Asahara等［20］于1997年报道在成人外周血中分离出EPCs。它是一群能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与人胚胎血管生成，而且在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并能以血管发生方式形成新生血管。这一发现，更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论，为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。有研究将EPCs与BMSCs及DBM共同构建促血管化组织工程骨，修复兔桡骨大段骨缺损取得良好效果［21］。Niagara采用VEGF和Ang-1双重基因转染的自体EPCs与MSCs混合培养，使EPCs能迅速转化为血管内皮细胞，分泌促血管生长因子，并促使MSCs向内皮细胞分化，从而促进组织工程骨的早期血管化［22］。

    5小结

    现阶段利用组织工程技术修复骨缺损的主要方向是：(1)选择合适的种子细胞并对其进行基因修饰。(2)构建复合支架材料，使其既具有良好的表面活性和三维立体结构，能特异性调控种子细胞的黏附、增殖、定向分化，又能有效控制特定生长因子的释放。(3)利用显微外科技术、EPCs、促血管生长因子及基因技术促进组织工程骨的早期血管化。

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