伊贝沙坦对糖尿病大鼠心脏的保护作用及抗氧化反应的机制探讨

【摘要】  　　【目的】 探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂伊贝沙坦对糖尿病大鼠心脏的保护作用及其相关机制。【方法】 将30只Wistar 大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组和伊贝沙坦组3组，每组10只。造模后12周终止实验处死大鼠，取血、尿和心脏标本，测定尿量、体质量、心脏质量/体质量、血糖、糖化血红蛋白（HbA1c）；测定血液和心脏组织的丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性；通过电镜观察心肌超微结构的变化。【结果】 12周终止实验时糖尿病各组大鼠的尿量、心脏质量/体质量、血糖、HbA1c、血清和心脏组织的MDA水平均明显高于正常组，而体质量、红细胞和心脏组织的SOD活性明显低于正常组（P< 0.05）；伊贝沙坦组大鼠的血清和心脏组织的MDA水平明显低于糖尿病组，而SOD的活性高于糖尿病组（P< 0.05）。糖尿病组大鼠的心肌细胞超微结构明显损伤，伊贝沙坦组大鼠的心脏组织超微结构损伤较轻。【结论】 伊贝沙坦能减轻糖尿病大鼠心脏损害的进展，其机制可能与伊贝沙坦抑制糖尿病大鼠脂质过氧化反应和提高抗氧化能力有关。

【关键词】  糖尿病； 大鼠； 伊贝沙坦； 丙二醛； 超氧化物歧化酶； 心肌； 超微结构

    Abstract: 【ob[x]jective】 To investigate the protective effects of irbesartan on myocardium and its anti-oxidative stress mechanism in diabetic rats. 【Methods】 Thirty male Wistar rats were randomly divided into three groups: control group(n=10), diabetic group(n=10), irbesartan group(n=10). At the end of 12 weeks, the rats were killed. Urine volume, body mass, heart mass/body weight, plasma glucose, glycosylated hemoglobin (HbA1c) were measured. Malondialdehyde (MDA) levels and superoxide dismutase (SOD) activity in serum or red blood cells and heart tissues were tested.  Myocardium was taken for electromicroscopy.【Results】 Urine volume, heart mass/body mass, plasma glucose, HbA1C, MDA levels of blood and heart tissue in diabetic rats were significantly greater than those of normal controls (P< 0.05). But body weight, SOD activity of blood and heart tissue in control group were higher than that of diabetic and irbesartan group. After 8 weeks of treatment, SOD activity of red blood cells and heart tissue in rats of irbesartan group were significantly higher than those of diabetic rats (P< 0.05). The injuries of the myocardium including sarcomeres, mitochondria and microvascular endothelial cells were less in irbesartan group than that in diabetic group. 【Conclusion】 Irbesartan could decrease the heart injury in diabetic rats. And the mechanisms might be that irbesartan can reduce the MDA levels and improve SOD activity in STZ-induced diabetic rats.

    Key words: diabetes mellitus; rat; irbesartan; malondialdehyde; superoxide dismutase; myocardium; ultrastructure

    糖尿病心肌病是糖尿病临床常见并发症之一，是导致糖尿病患者心力衰竭的主要原因，其发病机制尚未完全清楚。氧化应激反应在糖尿病心肌病的发生、发展中起重要作用，高糖可促进线粒体电子传递链生成的活性氧（reactive oxygen species, ROS），增加超氧自由基的生成，高糖还可损伤机体自身的抗氧化系统[1, 2]。动物实验发现链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的糖尿病小鼠，血管紧张素系统和氧化应激参与了糖尿病心肌病变的发病机制，血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ, ATⅡ）及其1类受体（angiotensinⅡtype 1 receptor, AT1）和肾素明显增加，使用AT1拮抗剂能抑制AT1和血管紧张素原，从而减少ATⅡ的合成和细胞的死亡[3，4]。但是有关AT1拮抗剂伊贝沙坦对糖尿病心肌病变的保护作用及其抗氧化反应尚未见报道，本实验旨在观察伊贝沙坦对糖尿病大鼠心脏的保护作用并探讨其可能的机制。

    1   材料与方法

    1．1   动物分组

    雄性、健康Wistar大鼠30只、体质量180~250 g、随机分为3组：① 正常对照组（正常组）、② 糖尿病未治疗组（糖尿病组）、③ 糖尿病伊贝沙坦治疗组（伊贝沙坦组），每组10只大鼠。所有大鼠均禁食12 h，各糖尿病组大鼠腹腔1次注射20 g/L STZ （Sigma公司） 50 mg/kg（溶于0.1 mol/L，pH 4.5枸橼酸缓冲液），正常组大鼠注射相当剂量的枸橼酸缓冲液，72 h后测随机微量血糖> 16.7 mmol/L（美国强生One TouchⅡ血糖仪），尿糖+++~++++，稳定3 d，可确定为糖尿病大鼠。糖尿病模型确立后第2天开始，伊贝沙坦组大鼠予以伊贝沙坦（安博维，杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司提供）15 mg/（kg·d） 剂量，经胃管灌服。正常组和糖尿病组仅给予等量蒸馏水灌胃。整个病程中糖尿病大鼠禁止使用胰岛素及任何降糖药。所有大鼠分笼用本校实验动物中心提供的标准饲料喂养，充分供给食、水。病程中每周测1次尿糖和体质量，每月测1次血糖，共观察12周。

    1.2   观察指标

    12周实验终止，留取24 h尿液，测尿量、测随机微量血糖，然后用30 g/L戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉，剖开胸腹，心内采血，取心脏标本，测量下列指标：① 血糖、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin, GHbA1C）：血糖检测采用葡萄糖氧化酶方法，GHbA1C采用微柱法检测。②红细胞和心脏组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的测定[5]：采用邻苯三酚自氧化法；③血清和心脏组织丙二醛（malondialdehyde, MDA）测定[5]：采用改良八木国夫法测定。④透射电镜观察心肌组织的变化。

    1.3   统计学处理

    计量数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，多组均数比较采用方差分析，如方差不齐，先采用秩和检验，再行组间Student-Newman-Keuls检验多重比较。检验水准α取0.05，所有数据均用SPSS11.0统计分析软件处理。

    2   结   果

    2.1   大鼠尿量、体质量、心脏质量/体质量、血糖、糖化血红蛋白的变化

    建模后糖尿病组和治疗组均出现明显的高血糖、多饮、多尿、多食、生长迟缓等临床表现。12周实验终止时，糖尿病组和伊贝沙坦组血糖、糖化血红蛋白、尿量、心脏质量与体质量的比值明显高于正常组，体质量明显低于正常组（P< 0.05），伊贝沙坦组心脏质量与体质量的比值明显低于糖尿病组（P< 0.05；表1）。

    2.2   大鼠红细胞和心脏组织SOD活性血清和心脏组织MDA水平的变化

    糖尿病各组大鼠红细胞和心脏组织的SOD活性均低于正常组（P< 0.05），经过治疗后，伊贝沙坦治疗组的红细胞和心脏组织SOD活性高于糖尿病组，但心脏组织SOD活性仍低于正常组(P<0.05)；糖尿病各组大鼠血清和心脏组织的MDA水平均高于正常组（P< 0.05），经过治疗后，伊贝沙坦治疗组的血清和心脏组织MDA水平低于糖尿病组，但高低于正常组(P< 0.05,表2)。

    2.3   大鼠心肌超微结构的变化

    与正常组大鼠心肌超微结构比较，糖尿病组大鼠的心肌细胞水肿，线粒体体积增大，变圆，嵴排列紊乱甚至断裂，糖原减少，甚至消失；闰盘结构模糊，提示心肌超微结构明显损伤。而伊贝沙坦治疗组大鼠肌原纤维无明显肿胀，排列整齐；线粒体无肿胀，膜清晰完整，但部分嵴模糊；糖原减少，但仍可见；闰盘结构清晰，说明心肌损伤较轻(图1~3)。

    3   讨   论

    糖尿病大鼠血糖值的确立标准以来各家报道不一致，多在（11.1～16.5）mmol/L之间。近年来，国内外基本倾向于认定血糖>16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠空腹或非空腹的成模标准[2]。本实验中，所有糖尿病大鼠在腹腔注射STZ 50 mg/kg 72 h出现多饮、多尿、多食，尿糖强阳性，随机血糖>16.7 mmol/L。病程中检测尿糖、血糖，始终在建模时的高水平波动，未见转复，故本实验中，糖尿病模型建立是成功的。

    Segar等[6]发现，STZ诱导的胰岛素依赖型糖尿病（1型糖尿病）鼠在8周时心肌超微结构出现明显病变，表现为心肌组织间隙扩大，肌小节结构丧失，线粒体肿胀变性，线粒体脊模糊，心肌细胞核变性。陈刚等[2]发现STZ诱导的糖尿病模型在10周时大鼠心肌出现明显的病变。本研究观察12周发现，与正常组大鼠心肌超微结构比较糖尿病组大鼠的心肌超微结构明显损伤，与文献报道相似[2，6]，证明了本糖尿病大鼠存在明显的心肌损伤。而伊贝沙坦治疗组大鼠心肌损伤较轻，表明伊贝沙坦可减轻STZ诱导的糖尿病大鼠心肌损害。

    与氧化应激密切相关的自由基主要为ROS，包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢和一氧化氮等。机体内存在两类自由基防御系统:一类是酶促防御系统,包括SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等；另一类是非酶促防御系统,包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽、α-硫辛酸和褪黑素等。它们对清除自由基、保护细胞及机体起重要作用。正常情况下,自由基反应对于机体防御机制是必要的,自由基的产生和清除保持平衡。但在某些病理情况下,体内自由基大大增加,同时机体抗氧化防御能力下降,氧化能力大大超过抗氧化能力而发生氧化应激,从而直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性，后导致细胞死亡或凋亡、组织损伤和疾病发生。ROS 还可作为重要的细胞内信使,活化许多信号传导通路,间接导致组织和细胞的损伤[7]。MDA是脂质过氧化的终产物，SOD是抗氧化的主要指标之一，MDA和SOD是目前的反应氧化应激水平的指标[7，8]。

    目前关于氧化应激反应在糖尿病心肌病的发病中作用尚不十分清晰，但是有研究发现高糖可促进线粒体电子传递链生成的电力梯度产生ROS，增加超氧自由基的生成，高糖还可损伤机体自身的抗氧化系统[1]。陈刚等[2]通过基因芯片也发现，氧化应激相关基因和能量代谢相关基因的表达水平在糖尿病性心肌病时明显下调。Singal等[9]的研究发现STZ诱发的糖尿病大鼠表现出抗氧化酶反应的降低和心肌脂质过氧化的增高，而抗氧化剂Probucol能提高心脏功能。Shen等[10]在糖尿病大鼠心脏过表达MnSOD基因，发现心肌SOD活性明显增加，同时可保护心脏免受外源性氧化剂的损伤。本实验结果发现糖尿病各组大鼠红细胞和心脏组织的SOD活性均低于正常组，经过治疗后，伊贝沙坦治疗组的红细胞和心脏组织SOD活性高于糖尿病组，但仍低于正常组；糖尿病各组大鼠血清和心脏组织的MDA水平均高于正常组，经过治疗后，伊贝沙坦治疗组的血清和心脏组织MDA水平低于糖尿病组，但高低于正常组，结果提示氧化应激参与了糖尿病心肌病的发病机制，而且伊贝沙坦对心肌的保护作用与其抑制脂质过氧化反应，提高机体抗氧化能力有关。

    Kajstura等[11]证实STZ糖尿病小鼠心肌存在肾素血管紧张素的激活和细胞的凋亡，通过转基因过表达胰岛素样生长因子，进而抑制p53的功能，减少ATⅡ产生及AT1的活性，从而减少氧化应激、心肌细胞死亡，延缓糖尿病心肌病的发展。Privratsky等[4]发现高浓度葡萄糖可刺激AT1和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶的表达，并抑制鼠心肌的收缩功能；使用AT1拮抗剂L-158,809或NADPH氧化酶抑制剂apocynin在改善心肌收缩功能的同时，降低ROS的产生。结果说明血管紧张素系统和氧化应激参与了糖尿病心肌病变的发病机制，而应用AT1拮抗剂可减轻ROS的产生，减轻糖尿病心肌的病变。

    本研究结果发现血管紧张素Ⅱ-1型受体拮抗剂伊贝沙坦能减轻糖尿病大鼠心脏损害的进展，其机制可能与伊贝沙坦抑制糖尿病大鼠脂质过氧化反应和提高抗氧化能力有关。

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