NK 细胞与复发性自然流产母胎免疫紊乱的研究

关键词】  自然杀伤细胞; 外周血自然杀伤细胞; 子宫自然杀伤细胞; 复发性自然流产
　编者按：张建平教授，中山大学孙逸仙纪念医院产科主任，博士生导师。现为中华妇产科学会妊娠期高血压疾病学组副组长、中华妇产科学会产科学组委员、广东省围产医学分会副主任委员、广东省优生优育协会委员。担任《中华妇产科杂志》、《中华围产医学》、《生殖医学》、《中国实用妇科与产科杂志》、《现代妇产科进展》、《实用妇产科杂志》等多本杂志的编委，是International Journal of Gynecology and Obstetrics特邀审稿专家。从事妇产科围产医学二十余年，近十年来针对顽固性不孕、多次试管婴儿失败、复发性流产等涉及的母体与胎儿间细胞免疫、体液免疫和细胞因子表达等诸多环节进行深入研究，如复发性自然流产患者外周血淋巴细胞Fas表达及其与NK细胞毒性的相关性研究、绒毛滋养细胞凋亡相关蛋白配体的表达、NK细胞毒性、T淋巴细胞亚群等。另外针对流产及各种不孕患者的微循环易栓倾向又开展了凝血因子、血栓前状态、抗凝血等一系列基础及临床研究，取得了良好的成效。对顽固性不孕、多次试管婴儿失败、复发性流产患者进行综合免疫学治疗，增强母体对妊娠产物的容受性从而使其获得良好的妊娠结局，成效显著，跻身水平。本刊特约张建平教授组织了“免疫与流产”专题。摘 要： 存在于外周血与子宫内膜层面的自然杀伤细胞(NK细胞)在妊娠免疫机制里面起着重要的调节作用，与复发性自然流产(RSA)中母胎免疫免疫紊乱机制相关。母胎界面存在各种不同的结构，促使其上不同功能的NK细胞亚群直接作用于滋养细胞。RSA妇女妊娠前后NK细胞数量和/或活性的变化一直是临床研究的热点。本文对NK细胞功能和导致RSA的可能机制进行回顾和综述，总结目前已获得的对外周血NK细胞和子宫NK细胞的研究进展，以及针对NK细胞紊乱的免疫治疗，探讨RSA的免疫学机制以及今后可行的治疗方向。
　Abstract： The natural killer (NK) cells in peripheral blood and endometrial la[x]yers have been associated with the maintenance of pregnancy immunological intolerance. And the regulation roles of NK cells are reviewed in relation to maternal-fetal interface immune dysfunction in recurrent spontaneous abortions (RSA). The placenta has a complex anatomical structure and different subsets of NK cells with various function can directly interact with trophoblasts. The alterations in NK cell numbers and / or activity in women with RSA before and after conception are a critical clinical concern. We have reviewed articles about NK cells 从上世纪Medawar提出胎儿是特殊的同种异基因移植物以来，随着生殖免疫学研究的进展，妊娠被视为一个独特的半同种移植过程。在母体免疫功能正常时，免疫系统既保护母胎不受外来微生物的侵犯，又维持针对宫内胚胎移植物的免疫耐受。这种母胎免疫关系的平衡表现为免疫排斥反应的减弱和免疫保护作用的增强。一旦母胎界面免疫耐受出现紊乱，则会导致不良妊娠结局，常见的表现就是自然流产的发生。复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion， RSA)是指连续发生两次或两次以上的自然流产，病因复杂，约有50%病因不明，而经过近20年的发展，逐渐明确所谓原因不明自然流产80%以上都与免疫因素相关[1]。自然杀伤细胞(natural killer cell， NK细胞)属于淋巴细胞谱系的细胞群，也称大颗粒淋巴细胞。NK细胞具有细胞毒性效应，无需抗原预先致敏就能自发杀伤靶细胞。NK细胞主要分布于外周血，占外周血淋巴细胞数量的10% ～ 15%，可以随血循环游走至各组织发挥效应，由于解剖结构和局部受体等影响可能使其在靶器官聚集定位而发挥作用[2]。非妊娠时期子宫NK细胞数量随月经周期的不同阶段而变化。在增殖期数量很少，排卵后迅速增加，分泌晚期达高峰。妊娠后，子宫细胞(uterine NK cell， uNK细胞)将持续存在于孕早期蜕膜中，尤其在底蜕膜上含量为丰富。种植期和早孕期间，NK细胞是子宫上主要的淋巴细胞群体。由于uNK细胞能够与胎儿滋养细胞直接接触作用，因此uNK细胞的毒性杀伤作用如出现亢进，将可能成为胚胎损伤的致命因素。从Aoki报道开始，NK细胞数量和功能等状况的异常一直被认为是导致RSA的重要因素[3]。
　　1 NK细胞亚群及其特点
　　1.1 表面标志及分类
　　人类NK细胞分布在外周血，各种淋巴结及源自CD34+ IL-2Rb链阳性造血干细胞前体的非淋巴结器官。由于分布和作用器官不同，这些NK细胞在功能和表型上都显示出差异。绝大多数NK细胞表现为缺乏CD3因子，但表达CD56抗原。根据CD56抗原的密度，分为CD56+(CD56bright)和CD56-(CD56dim) NK细胞。而是否存在FccRIII或者CD16因子又可进一步对NK细胞进行分类。大多数外周血NK细胞为CD56-CD16+，其余为CD56+CD16-。人类NK细胞大部分(近90%)为CD56-，几乎不表达NK细胞源性的细胞因子，但却是抗体依赖细胞毒性反应(ADCC)、LAK反应和自然细胞毒性反应的介导。这些细胞是有效的杀伤细胞，比其他的NK细胞亚群毒性更强。甚至静止态的CD56-细胞都比CD56+细胞具有更大的细胞毒性[3-4]。
　　女性生殖道(包括子宫内膜、宫颈和输卵管)NK细胞主要为CD56+ CD16- CD9+ CD94+。CD56+ NK细胞被视为NK细胞源性的细胞因子的主要来源，也是重要的炎性和调节性亚群[5-6]。CD56+ 细胞与CD56- 细胞在功能与表型上完全不同，相较于CD56- 细胞，CD56+ 细胞分泌的IL-10多25倍。多数的子宫NK细胞为CD56+ CD16-，因此，主要起炎性反应或调节作用。这些细胞是一系列促血管生成因此的重要分泌器，诱导蜕膜上血管生成[7]。
　　1.2 抑制性受体和激活受体
　　迄今已发现数10种NK细胞受体，分为抑制性和激活性受体。NK细胞的活化发挥杀伤功能是由激活和抑制性受体信号的复杂相互作用控制，并由细胞因子调节。
　　1.2.1 MHC-I抑制性受体
　　人类和小鼠的滋养细胞中都不具备MHC-II类分子，MHC-I类分子也是限制性表达。高度多态性的人类白细胞抗原I类分子HLA-A和HLA-B在绒毛和绒毛外滋养细胞上都不表达。但是侵入子宫生长的绒毛外滋养细胞(EVT)上却表达HLA-C。EVT细胞也表达非经典性的MHC-I类分子，比如HLA-G和HLA-E。侵入生长的滋养细胞上父系HLA-C分子的出现，使得这些细胞可能成为同种异体免疫反应的潜在攻击目标。但在正常妊娠中HLA-C和HLA-G、HLA-E都可以被NK细胞上的MHC-I特异性抑制受体识别，而免受攻击[2]。
　　EVT细胞能够被子宫NK细胞上的多种抑制性受体识别，如KIR2DL2/3与KIR2DL1，免疫球蛋白样转录体2(ILT2)和CD94/NKG2A等，这些受体也分别是HLA-C，HLA-G和HLA-E的特异性受体，组成不同的HLA/KIR配对，并影响NK细胞的分泌功能。不同的HLA/KIR配对作用，维持了uNK细胞的活化程度平衡。缺乏抑制性受体信号时，NK细胞的活化增加;而抑制性受体过多，导致抑制性信号占主体时，子宫NK细胞会表现出低反应性，以致胎盘形成不良，引发流产。不明原因RSA妇女MHC-I特异性抑制受体表达受限，胎儿表达抑制性KIRs也更少，导致胎儿滋养细胞被uNK识别而受到损伤[8]。
　　1.2.2 激活性受体
　　激活性受体是近年研究的结果，分属于MHC型和非MHC型。前者一般与相对应的抑制性受体相互交联，传递活化激活信号。RSA患者在体内MHC-I抑制性受体表达受限同时，MHC-I特异性活化受体基因数量增加。这意味着子宫NK细胞接受到更多的活化信号，变成高反应性，也有可能发挥杀伤细胞作用[8]。
　　1.2.3 NK细胞受体的基因调控
　　NK细胞受体含有杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)能够识别表达在靶细胞上的HLA-C的特异性等位基因。这些KIR具备多态性。KIR位点的基因变化会影响其对于RSA的易感性。同一妇女的蜕膜和外周血NK细胞上的KIR表达存在表型差异[9]。因此，蜕膜和外周血NK细胞上的KIR表达必须分别进行探讨。RSA妇女的蜕膜NK细胞上发现了一组限制性KIR家族抑制性受体(inhKIR)。许多蜕膜NK细胞缺乏对胎儿KLA-Cw抗原特异的inhKIRs。因此，RSA妇女体内母体限制性inhKIR与缺乏母体inhKIR的胎儿HLA-C抗原决定基无法成功匹配，不能释放信号抑制NK细胞活化，保护胚胎。减少inhKIRs的配体能降低由激活受体介导的NK细胞活化的阈值，因而可能部分解释RSA的发病机制[8]。
　　2 外周血淋巴细胞
　　综前所述，外周血NK细胞(pNK)与子宫NK细胞(uNK)在表面标志、受体表达及受体基因调控等方面均存在不同。外周血NK细胞研究由于取样相对便捷，而且可以长期追踪，目前大部分的研究及文章均以pNK 细胞为主要研究对象。
　　2.1 外周血NK细胞水平
　　根据研究资料显示，无论在RSA患者或正常对照妇女中，妊娠前后外周血NK细胞水平并没有明显改变[1]。具体分析到NK细胞亚群，相较于非妊娠妇女，CD56+/16+ NK细胞在妊娠妇女中明显降调[10]。37.3%的RSA患者外周血CD56+ NK细胞表现为轻到中度升高(幅度12% ～ 18%)，14.7%为显著升高( > 18%)。NK细胞增加水平 < 12%的患者，通常可以维持妊娠至足月[10-11]。在RSA患者中，降调NK细胞水平往往能够改善妊娠结局。
　　RSA患者CD56+ NK 细胞表达的CD69也比正常对照妇女明显升高[12]。外周血高水平的NK细胞也意味着下次不伴染色体核型异常的妊娠可能发生生化妊娠或自然流产[13]。进行概率计算，妊娠妇女(排除供卵，或接受ICSI治疗，未经过IVIg治疗，也不是多胎妊娠)CD56+ 细胞水平升高预示下次非染色体异常的妊娠可能发生流产，其特异性为87%，阳性预测值也达到78%。该项检验的特异性在不孕和RSA患者中都相当高，而在RSA患者中，敏感性更达到86%。Yamada 等[14]报道采用外周血CD56+ NK细胞的比例作为染色体正常妊娠发生生化妊娠和自然流产的预测指标(截点选择CD56+ >16.4%)。其中发生生化妊娠和自然流产的相对风险比为4.9。
　　检查CD56NK细胞比例变化有助于有RSA妇女孕期监测;NK细胞水平变化能预测病理妊娠结局。今后，还需要更深入的研究提高敏感性和阳性预测值。患者的选择指标，NK细胞亚群的测量，新的检查指标，研究进行的时机和分析手段都需要进行更进一步考量。
　　2.2 NK细胞毒性(活性)
　　许多研究NK细胞毒性和妊娠结局的文章已经发表。孕前高水平外周血NK细胞毒性与RSA妇女再次妊娠发生流产相关。胚胎染色体正常而发生流产的妇女，其孕前NK细胞活性已经明显比那些之后能够成功妊娠的妇女高得多[2，14]。
　　能够继续妊娠并活产的妇女，在妊娠极早期(孕4 ～ 5周)的NK细胞活性会在之后(孕6 ～ 7周和孕8 ～ 9周)明显下降。而发生流产的妇女(排除染色体因素)，NK细胞毒性在孕6 ～ 7周时比能够继续妊娠的妇女要高得多。因为染色体异常导致流产的妇女孕6 ～ 7周时的NK细胞毒性则与能够继续妊娠的妇女相当。孕前高水平的NK细胞毒性( > 46%，相对风险值 3.6. 95% CI 1.6-8.0)和高浓度NK细胞( > 16.4%;4.9，1.7-13.8)都预示再次妊娠，不伴染色体异常时仍可能发生生化妊娠和自然流产[15]。在既往RSA病史的妇女经过免疫治疗后成功妊娠，大多数经检查发现体内维持低水平NK细胞活性[16]。
　　NK细胞毒性增加与IL-2升高相关;NK细胞毒性和IL-2的同时增加可能是发生RSA的危险因素[17]。a2V-ATP酶在PBMC表面表达，调节细胞外环境，促进NK细胞毒性或者细胞因子表达[18]。RSA患者体内，CD56+ NK细胞上的NKp46， NKp44， NKp30的表达和a2V-ATP酶都比CD56- NK细胞上显著上调[19]。这项研究显示了RSA患者体内NK细胞毒性和细胞因子产物的失控状态。
　　流式细胞分析NK细胞毒性，准确可靠，能够对患者样本进行检查。有研究显示，外周血NK细胞活性与CD56+/16+， CD56+/16- 或CD3+/56+ 淋巴细胞亚群的计数和比例不相关。因此，NK细胞毒性检查和外周血NK细胞数量代表了NK细胞作用的不同方面，二者并不相关联[20]。对外周血NK细胞的各种检查分析为RSA的诊断提供帮助。对NK细胞的免疫调节也可能成为有效的治疗方式。
　　2.3 对NK细胞的免疫治疗
　　由于研究条件的限制，针对NK细胞异常进行的免疫治疗，疗效观察和机制研究仍然集中于外周血NK细胞的观察。
　　2.3.1 静脉用免疫球蛋白(IVIg) 静脉注射免疫球蛋白制剂从人血中制备，早用于治疗免疫缺陷症。初于20世纪80年代用于预防RSA。可能从3种途径抵抗免疫缺陷的影响。首先，它可能是活性NK细胞的抑制剂。第二，包含多种抗异型抗体，能够减少各种有害抗体的损伤，从而保护胚胎。第三，IVIG能够灭活参与免疫反应的活性T细胞和多克隆性B淋巴细胞。
在因NK细胞缺陷而导致RSA的小鼠模型上，腹腔注射IVIg后，小鼠能够成功分娩。Dr.Sher等也报道IVIg能够明显抑制NK细胞活性。一些日本的研究者在不明原因RSA患者使用IVIg后，发现IVIg通过增加外周血NK细胞中CD94的表达发挥对胚胎的保护作用[21]。Clark DA对3个公开发表临床随机对照实验结果进行了me[x]ta分析，发现使用免疫球蛋白治疗可提高活胎生产率，并有统计学意义。而对另外两个队列对照研究的me[x]ta分析也有同样结果。从而在更广泛的层面上对关于免疫球蛋白治疗的效果进行了确认。
　　但是由于IVIG 是血源性制品，仍存在着血源性传染疾病的可能。而且由于价格昂贵，临床使用的范围并不大。因此，研究人员也在不断寻找可以替代IVIG进行治疗的新药物。
　　2.3.2 治疗新选择
　　脂肪乳剂(intralipid)能够活化免疫系统。动物和人类试验都证实静脉注射脂肪乳能够增加种植成功率并能维持妊娠。Roussev RG等[22]发现使用20% Intralipid(静脉内用脂肪乳剂)能够在体外成功抑制反复生育失败的妇女的外周异常NK细胞的细胞毒性作用。脂肪乳剂价格便宜，因为不是血制品，使用相对安全。如果脂肪乳剂的治疗效果可以得到后的肯定，将会在临床获得更广泛应用。
　　恩利(Enbrel)为肿瘤坏死因子TNF受体，是一种新型的重组蛋白药物，初的适应症是类风湿关节炎。它主要的作用机制是抑制由活化NK细胞分泌的内膜毒性因子TNF-a。近有研究显示Enbrel在阻断TNF-a释放的同时还可以灭活活性NK细胞[23]。如果今后的研究能够获得证实，那么Enbrel将可能替代IVIG对升高的毒性NK细胞水平进行治疗。已经有部分试验证实Enbrel确实在治疗复发性自然流产中发挥作用。
　　3 子宫NK细胞
　　妊娠时，NK细胞在母胎界面大量聚集。种植期和早孕期间，NK细胞是子宫上主要的淋巴细胞群体。子宫NK细胞能直接与胚胎滋养细胞作用，因此，目前对于子宫NK细胞的研究也越来越深入。
　　3.1 uNK细胞来源
　　蜕膜上的CD56+ CD16- NK细胞的来源尚不清楚，但由于它们同血液中少量无颗粒性CD56+ NK细胞群紧密联系，一种推断认为血液内的NK细胞游走进入子宫增殖，分化。但CD56+子宫NK细胞与CD56+ 外周血NK细胞并不相同，因为二者在CD9，CD103和KIR的表达上不同。外周血CD56+ CD16- NK细胞由于表达L选择素(CD62L)和受体CXCR4能够与蜕膜上的绒毛外滋养细胞上的配体CXCL12作用，而被募集到内膜和蜕膜[24]。子宫NK细胞(CD56+)的募集和增加并不依赖需要种植的胚胎的出现，它是被激素控制的(雌激素和/或孕激素)[25]。
　　近有报道，蜕膜基质细胞产生TGF-b能够将CD56- CD16+ NK细胞转化为CD56+ CD16- NK细胞，这意味着组织存在特异性终末分化选择[25]。这可能是个可逆性的转化过程。但是体外试验显然是个相当复杂的过程，并且无法模拟体内的募集过程。
　　3.2 uNK功能
　　妊娠时(无论正常或流产)母胎界面出现的大量uNK细胞聚集，有理由认为uNK细胞并不仅仅发挥细胞毒性作用，更可能是维持妊娠的一个重要因素。
　　3.2.1 血管生成作用
　　妊娠的发生，需要提供一个充足的需氧环境满足胎盘的形成，早期胚胎生长和胎儿发育。这在进化上表现为母体螺旋小动脉的重构。正常的血管平滑肌弹性结构转变为螺旋小动脉管腔更大，壁更薄，阻力小的可扩张的结构。妊娠期间子宫NK细胞的功能就是支持子宫螺旋动脉的重构，通过调节滋养细胞侵入生长而促使胎盘形成[27]。
　　人类中早孕期间，子宫NK细胞占蜕膜免疫细胞的70%左右。这些子宫NK细胞具备CD56+CD16- 的细胞表型标志物，而外周血中95%的NK细胞为CD56- CD16+，仅有5%表现为CD56+CD16-。外周血中的CD16- NK细胞表现出强烈的细胞毒性，而CD56+ NK细胞则是低毒性效应，而且可以分泌各种细胞因子。IFN-c是子宫NK细胞分泌的重要细胞因子，促使血管重构，以及正常内膜的蜕膜化变化[28]。子宫NK细胞还分泌其他几种重要的血管生成因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)，血管蛋白-2和胎盘生长因子(PIGF)[29]。子宫NK细胞还能调节滋养细胞侵入生长。
　　子宫NK细胞至少在功能上可以部分促进胎盘形成，对维持妊娠起正面影响。
　　3.2.2 uNK细胞毒性作用
　　与活化的外周血NK细胞一样，子宫NK细胞也能表达细胞毒性受体，并具有溶解靶细胞的能力，但是正常妊娠中表现为低毒性和血管生成活性。因此有研究者认为正是因为uNK细胞表现出了强大的血管生成活性，因而不表现其毒性杀伤作用[30]。虽然这种机制尚不明了，但是一旦内环境改变或者发生炎症反应，子宫NK细胞可能从保护性作用转化为毒性杀伤作用。近的报道都显示RSA患者的发病机制确实与毒性uNK细胞的作用相关。
　　3.2.3 uNK细胞导致RSA患者的病理损伤
　　与选择性人工流产的患者相比，RSA妇女在种植位点上发现了更高比例的异常胎盘损伤。对终自发流产的患者进行免疫病理学检查，发现胎盘种植位点上存在明显升高的CD57+ NK细胞(29.6%)，细胞滋养细胞侵蚀深度不足(54.1%)，合体滋养细胞形成不全(44.1%)，蜕膜血管血栓形成(33.9%)[31]。这一发现显示由于缺乏细胞间信息传导，改变了正常的种植过程，诱发了胚胎死亡，导致了流产的发生[32]。
　　对RSA患者子宫内膜和蜕膜进行免疫组化研究，仍然存在一定的局限性。在NK细胞分析上存在各种不同的意见。每一组研究中，对NK细胞群体，标志物的选择，调控方式都各不相同。使用CD57单克隆抗体进行研究，发现蜕膜上NK细胞增加;采用CD56就不会发现有任何变化[33]。这种差异可能是由于选择病例的指征不同，样本采集的时机无法掌握，黄体功能不全出现的影响，NK细胞亚群和标志物选择不能统一等造成[34]。
　　4 结 论
　　正常妊娠的维持是母胎免疫耐受的结果，不明原因RSA患者是免疫耐受机制被破坏的结果，NK细胞正是这种免疫病理损伤的部分原因。因为表面标志物、受体和基因调控的不同，对RSA患者存在影响的是外周血NK细胞和子宫NK细胞。外周血NK细胞的数量/比例和毒性代表了NK细胞作用的不同方面，因此对于RSA患者进行NK细胞数量/比例和毒性检查能够对诊断和治疗提供帮助。母胎界面的uNK细胞大量聚集，直接作用于胎儿滋养细胞，因此在这种免疫损伤里面发挥直接作用。uNK细胞与外周血NK同样具备细胞毒性，但其在未被活化时具有的血管生成功能对维持妊娠的起重要作用，一旦被激活则才发挥细胞毒性，成为胚胎损伤流产发生的直接原因。但是对uNK细胞进行组织学检查时仍然存在局限性。
　　今后研究的方向仍然是对NK细胞在导致RSA免疫病理机制的继续研究，并探索更可行的治疗方法。
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