观察CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

【摘要】  目的 应用反义RNA技术特异性下调结缔组织生长因子(CTGF)的表达，观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制。方法 培养原代VSMC，使用脂质体法将携带有CTGF反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染入VSMC，Western Blot技术观察CTGF的表达以及蛋白激酶B(Akt)的活性，MTT法及划痕试验测定VSMC增殖和迁移情况。结果 pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染VSMC后CTGF的表达明显降低，Akt的活性降低，VSMC的增殖和迁移受到明显抑制。结论 应用反义RNA技术可特异性下调CTGF表达，并通过降低Akt的活性抑制VSMC的增殖和迁移。 发展。AS病灶中CTGF的mRNA和蛋白质较正常的血管内有较高表达，可见CTGF在AS的发生和发展中有着重要意义［5］。科学实验中心构建。羊抗大鼠CTGF多克隆抗体， ECLTM 显影液，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(美国Santa Cruz 公司);Akt和磷酸化Akt抗体，平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体(美国Sigma公司);低糖DMEM 培养基(美国Gibco 公司);小牛血清，胰蛋白酶(杭州四季青生物工程公司);其他试剂均为国产分析纯产品。计算平均值，根据这些数值计算划痕愈合指数。划痕愈合指数＝(初始划痕宽度-愈合后划痕宽度)/初始划痕宽度。转贴于 中国论文下载中心 http://www.studa.net

【关键词】  血管平滑肌细胞 结缔组织生长因子  细胞迁移 反义RNA

    Abstract：ob[x]jective  To specifically down-regulate the ex[x]pression of CTGF by applying anti-sense RNA technique and observe its effect on proliferation and migration of VSMC. Methods  Primary VSMCs were cultured by adherence method. Anti-sense RNA technique was applied to specifically down-regulate the ex[x]pression of CTGF. ex[x]pression of CTGF and activity of Akt were detected by WB. Proliferation and migration of VSMC were determined by MTT and scratch assay. Results  Transfer of pcDNA 3.1(+)-CTGF(-) could specifically down-regulate CTGF ex[x]pression and the activity of Akt. The proliferation and migration of VSMC were inhibited. Conclusions   Specific down-regulation of CTGF ex[x]pression by anti-sense RNA technique could inhibit the proliferation and migration of VSMCs by decreasing the phosphorylation of Akt.

    Key words：vascular Smooth muscle cell (VSMC);connective tissue growth factor (CTGF);cellproliferation;cell migration;anti-sense RNA

    动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，AS)始于血管内膜损伤［1］。在AS发生前，常有多种因素的刺激对血管内膜造成损伤，内皮细胞发生功能性和器质性改变，造成通透性改变和分泌功能障碍，促进血液中的脂质进入动脉壁。内皮细胞和动脉中层的血管平滑肌细胞(vascular endothelial cell，VSMC)进一步激活，大量合成并分泌多种生长因子，使自身和周围细胞大量增殖，增殖的VSMC还可迅速合成胶原等细胞外基质［2］，促使VSMC在损伤修复过程中发生纤维化，形成瘢痕修复，血管壁在结构和功能上发生了变化，终导致了AS的形成 ［3］。

    结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是从培养的人脐带静脉血内皮细胞的条件培养基中发现的。有研究表明［4］，CTGF参与了血管的损伤修复，能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成，促进AS的

    本课题旨在探讨CTGF在AS中对VSMC增殖和迁移的影响并明确其相关机制，为CTGF对动脉粥样硬化性血管狭窄病变过程的影响提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1月龄SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。CTGF反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CTGF(-)质粒由辽宁医学院

    霍晓川，等：CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响辽宁医学院学报  2008年2月，29(1)1.2  实验方法

    1.2.1  VSMC的培养和鉴定

    处死大鼠浸于75%乙醇中消毒10 min。无菌状态取出双侧颈总动脉，去除血管外结缔组织，剖开血管，刮去内膜，剥离外膜，将中膜剪成1 mm2左右的组织块植入经明胶包被处理的培养皿中，种植密度约为1块/cm2，37 ℃、5%CO2的培养箱培养倒置培养2 h，待组织块贴壁后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，培养1周左右，待细胞爬出融合后，用0.125%的胰蛋白酶进行消化、传代，VSMC镜下见典型的“谷峰样”生长特点，平滑肌α肌动蛋白(α-actin)免疫细胞化染色阳性，证实为VSMC。选3～5代对数生长期VSMC进行实验。

    1.2.2  实验分组

    取培养第3～5代的VSMC细胞30瓶（5×104／mL），随机分为３组：反义RNA组，对照组及空白组，每组10瓶细胞。分别实施pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染、空白脂质体转染以及空白处理。

    1.2.3  pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染VSMC

    转染前更换无血清培养基，待VSMC生长到50%～60%后，加入含有4 μg pcDNA3.1(+)-CTGF(-)的转染复合物，置于37 ℃，5%CO2培养箱孵育。4 h后移除转染复合物，加入无血清培养基，置于37 ℃，5%CO2培养箱孵育48 h后，备用于指标检测。

    1.3  指标检测

    1.3.1  Western blot检测３组细胞CTGF表达和Akt磷酸化状态。

    取第3～5代VSMC长至次融合后，给予相应干预因素后，无血清DMEM培养24 h，使细胞统一于G0期，加入700 μＬ预冷的改良RIPA裂解缓冲液(Tris-HCl， 50 mmol/L， pH7.5;NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%;脱氧胆酸钠，0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1.0 mmol/L; PMSF，1.0 mmol/L; Leupeptin， 2.0 μg/mＬ)裂解细胞，冰浴30 min，其间不时摇晃培养瓶;收集细胞，10 000 g4 ℃离心15 min，上清液即为细胞提取物，保存样品于-20 ℃备用。BCA-100蛋白质定量测定试剂盒检测总蛋白浓度。按分子克隆的操作进行免疫印迹杂交测定:取样本30 μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。1:500稀释的抗CTGF多抗杂交4 ℃过夜，1:5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗杂交1 h，ECL显影液放射自显影，以20 min曝光时间较佳。图像分析由Total Lab分析软件进行光密度扫描。

    1.3.2  甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测各组VSMC增殖情况

    第3代VSMC按5×104/mL接种于96孔培养板上，每孔0.1 mL，培养24 h后进行各分组的相应处理，测定前2 h加入MTT，置于37 ℃孵育箱中保温2 h以上，弃去上清液，加DMSO 150 μL/孔，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm 处测定OD值。每培养板接种12孔，每天取1板，连续测7 d，绘出生长曲线。

    1.3.3  划痕实验检测各组VSMC迁移情况

    各组细胞接种于在35 mm的培养皿中(2×105/mL)，待细胞汇合成单层用灭菌移液器头在细胞上小心的做一个划痕，PBS漂洗3次，显微镜下拍照，然后加入含10 μg/mL衣霉素的培养液继续培养，各组细胞于第24 h观察划痕愈合情况，显微镜下拍照，选取3个不同的位置，用刻度尺测量划痕宽度，

    1.4  统计学分析

    各组细胞指标检测内容重复测量3次，所有数据以x±s表示，采用SPSS12.0软件，首先进行方差齐性检验，然后进行重复测量的方差分析进行比较分析，P＜0.05为有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  原代VSMC形态及细胞特异性蛋白免疫组化的鉴定

    倒置相差显微镜下单个平滑肌细胞呈梭形或带状，有多个细胞突起，胞浆丰富，胞质密度高，不透明，核卵圆形居中，有多个核仁。细胞生长致密时平行排列成束，部分重叠，表现为典型“谷峰状”生长。培养第5代的细胞经特异的平滑肌α-actin免疫细胞化学染色后，胞浆着色，呈阳性反应，高倍镜下可见胞浆内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α肌动蛋白丝，细胞来源于VSMC(见图1)。

    2.2  Western blot检测转染后CTGF的表达

    Western blot结果显示，反义RNA转染组VSMC中CTGF的表达水平显著低于对照组和空白组(P＜0.05)，结果表明CTGF反义RNA转染能够有效的下调VSMC内CTGF的表达 (见图2)。

2.3  MTT法测定下调CTGF表达对VSMC增殖的影响发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等［5］。研究表明［6］，CTGF能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成， CTGF-mRNA及其蛋白质在动脉粥样硬化血管中的表达比在正常血管中高50～100倍。治疗方法打下基础。【参考文献】
  ［1］ Lauer MS. Primary prevention of atherosclerotic cardiovascular disease: the high public burden of low individual risk ［J］. JAMA，2007，297(12):1376-1378.

［2］ O'Brien KD， Lewis K， Fischer JW.Smooth muscle cell biglycan overex[x]pression results in increased lipoprotein retention on extracellular matrix: implications for the retention of lipoproteins in atherosclerosis ［J］. Atherosclerosis，2004，177(1):29-35.

［3］ Cai X. Regulation of smooth muscle cells in development and vascular disease: current therapeutic strategies ［J］. Expert Rev Cardiovasc Ther，2006，4(6):789-800.

［4］ Hughes JM，Kuiper EJ.Advanced glycation end products cause increased CCN family and extracellular matrix gene ex[x]pression in the diabetic rodent retina ［J］. Diabetologia，2007，50(5):1089-1098.

［5］ Game BA，He L. Pioglitazone inhibits connective tissue growth factor ex[x]pression in advanced atherosclerotic plaques in low-density lipoprotein receptor-deficient mice ［J］. Atherosclerosis，2006，8(11):85-101.

［6］ Cicha I， Yilmaz A， Klein M. Connective tissue growth factor is overexpressed in complicated atherosclerotic plaques and induces mononuclear cell chemotaxis in vitro ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(5):1008-1013.

［7］ Ohtsuka M， Miyashita Y.Lipids deposited in human atheromatous lesions induce apoptosis of human vascular smooth muscle cells ［J］. Atheroscler Thromb，2006，13(5):256-262.

［8］ Galaria II， Nicholl SM. Urokinase-induced smooth muscle cell migration requires PI3-K and Akt activation ［J］. Surg Res，2005，127(1):46-52.

    大鼠的VSMC经分离、培养和传代后，取第3-5代VSMC，经过相应因素处理后，MTT法检测反义RNA组、对照组和空白组第1 d至第7 d细胞增殖状况，绘制细胞增殖曲线，结果显示CTGF反义RNA组VSMC的增殖较其它组受到显著的抑制，表明下调VSMC内CTGF的表达能够明显的抑制VSMC的增殖(见表1，图3)。 表1  MTT法检测第1～7d细胞增殖(OD值)因素

    大鼠的VSMC经分离、培养和传代后，取第3-5代VSMC，经过相应因素处理后，划痕试验法检测反义RNA组、对照组和空白组0 h及24 h创口愈合情况，结果显示CTGF反义RNA组VSMC的创口愈合较其它组受到显著的抑制，表明下调VSMC内CTGF的表达能够明显的抑制VSMC的迁移(图4)。

    2.5  Western blot测定细胞Akt的表达和磷酸化水平

    为了进一步探讨下调CTGF表达后，VSMC增殖和迁移受到抑制的相关机制，我们通过使用Western blot技术测定各组细胞内Akt的表达以及磷酸化Akt的表达情况。Akt的活性是通过其磷酸化程度而得到实现的，我们的实验结果显示下调CTGF表达可降低Akt磷酸化的水平，而对Akt总量的表达无影响(图5)。

    3  讨    论

    CTGF初是在血小板源性生长因子的诱导下从人脐静脉内皮细胞cDNA库中克隆出来的，是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，其分子量为36～38 kD。它广泛表达于人类多种组织器官中，在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生

    VSMC是一种多功能性间叶细胞，其功能主要是通过收缩和舒张来维持血管壁的张力，通过增生和ECM ，来维持血管的完整性。VSMC的增殖、迁移可导致新生内膜形成，这在血管损伤修复后AS形成和发展的过程中起到了关键性的作用，如何有效的促进损伤血管壁的修复，抑制VSMC的过度增殖和迁移是控制动脉粥样硬化进展的关键步骤［7］。

    细胞增殖和迁移是一个严格的受控过程，受细胞内外多种信号分子的调节。蛋白激酶B(Akt)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞分化、细胞生长、细胞迁移等过程中具有重要的调节作用，目前的研究表明Akt的磷酸化水平增高可以促进细胞增殖和迁移［8］。本研究通过反义RNA技术能够特异性的下调CTGF的表达，并且经过进一步的实验研究证实，下调CTGF的表达可以通过减少Akt的磷酸化来显著降低VSMC的增殖和迁移能力。

    CTGF在AS病变整个发生发展过程中起着的不同作用，本实验初步探讨了CTGF对VSMC增殖和迁移的影响，丰实了动脉粥样硬化性缺血性脑血管病发病机制的研究。而AS的影响因素毕竟是多方面的，我们应继续深入综合研究其相关影响因素，为动脉粥样硬化性脑血管病开辟有效的