血管内皮生长因子在肝癌中的作用

作者：顾宇,陆枫林　　作者单位：东南大学附属中大医院 消化科，江苏 南京 210009

　　【关键词】 血管内皮生长因子;肝癌;血管生成;文献综述

　　肝细胞肝癌(HCC)属于多血管性实体瘤，实体瘤若没有血管生成提供足够的血供，其直径不会超过2 mm，肿瘤不能持续生长并发生坏死。因此，血管生成在肿瘤的发生发展中起至关重要的作用，肿瘤的血管生成由多种血管生长因子调控,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)与其受体(vascular endothelial growth factor receptors,VEGFR)在肿瘤血管生成中起重要的作用。作者就肝癌中VEGF与VEGFR的研究进展进行简要综述。

　　1 VEGF结构和作用

　　VEGF是1989年由Ferrara发现的，是重要的血管生成调节因子。VEGF家族属于血小板源性生长因子(PDGF)/VEGF超家族成员，有同源二聚体结构，在单体肽链上含有8个半胱氨酸残基。VEGF家族至少包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、胎盘生长因子(PIGF)以及T.f. svVEGF等7个成员，其中T.f. svVEGF是近在蛇毒中发现的[1]。

　　人VEGF基因位于染色体6P21.3，全长28 kb，由8个外显子和7个内含子组成，其cDNA基因长14 kb，编码相对分子质量为34～45 000的同源二聚体糖蛋白。亚基之间通过二硫键相连，如果二硫键断裂，则丧失所有生物学活性。VEGF基因经过转录水平的剪切可产生5种不同的转录子，人类至少有5种VEGF，分别由121、145、165、259和206个氨基酸组成。其中VEGF206含有全部8个外显子序列，VEGF189和VEGF165分别缺失部分或全部第6外显子，VEGF121缺失第6、7外显子，VEGF145则保留了第1、8外显子，VEGF165的表达有某种优势。VEGF的N端含有26个疏水性氨基酸组成的信号肽，主要由基因结构中的第1外显子编码。除VEGF121和VEGF145外，其余的VEGF均部分或全部与细胞表面含肝素的蛋白聚糖结合。VEGF165是发挥生物学效应的主要成分，通过与VEGFR结合而发挥生物学作用。

　　VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，其生理学上主要功能有:(1)选择性增强血管内皮细胞有丝分裂,刺激内皮细胞增殖并促进血管形成;(2)增强血管尤其是微小血管的渗透性,使血浆蛋白等大分子外渗沉积在血管外的基质中,为新生毛细血管网的建立提供营养。VEGF对肿瘤的影响机制可能有[2]：(1)促进肿瘤血管形成,这与VEGF能增加血管通透性、促进血管内皮细胞增殖、促进血管支持物生长有关。VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD及其受体VEGFR1、VEGFR2等均参与此机制。(2)促进肿瘤淋巴管生长,参与此功能的主要为VEGFC、VEGFD及受体VEGFR3,与肿瘤生长和淋巴管转移密切相关。(3)对肿瘤细胞的细胞动力影响。目前VEGF对肿瘤细胞增殖的影响还存在着争论,但对抑制肿瘤细胞凋亡的作用已获得一定的共识,VEGF可诱导抗凋亡蛋白Bcl2的表达,直接抑制肿瘤细胞的凋亡。(4)增强肿瘤细胞对放疗的耐受性及影响免疫功能。VEGF降低癌细胞对放射线的敏感性,可能与血管的形成相关。而对免疫功能的影响则主要是VEGF诱导造血干细胞的分化和成熟。

　　2 VEGFR结构和作用

　　VEGFR家族包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(KDR/Flk1)和VEGFR3(Flt4)3个成员，其中VEGFR1和VEGFR2结合VEGFA，在血管化的调控中起至关重要的作用。VEGFR3结合VEGFC和VEGFD，作用是刺激淋巴管发生[3]。

　　VEGFRs胞外区有7个免疫球蛋白结构域，胞内区有酪氨酸激酶活性，该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活,由受体磷酸化而引起细胞内许多酶发生反应,在细胞的生长和分化中起重要作用。

　　VEGFRs主要在内皮细胞上表达，少数一些细胞如滋养层细胞、单核细胞、造血干细胞及某些肿瘤细胞也表达VEGFR，缺氧和VEGF作用使VEGFR，特别是VEGFR1和VEGFR2在内皮细胞和肿瘤组织表达上调。不同VEGFR被VEGF活化后产生的效应不同，VEGFR1不仅在血管内皮细胞上表达，而且在单核巨噬细胞中也有表达，作用是刺激骨髓源性细胞的迁徙。巨噬细胞即通过VEGFR1信号迁徙到肿瘤或炎症组织中刺激血管和淋巴管的生成[4]。还有报道说VEGFR1能促进成骨细胞分化以及调节急性淋巴细胞性白血病细胞在骨髓中的定位，调节它们在循环中的存活[5]。VEGFR2对血管增殖比VEGFR1重要，是血管形成的主要信号，VEGFR2信号在血管系统发育中是必须的。VEGFR3主要表达在淋巴内皮细胞，调控淋巴发生以及其配体VEGFC和VEGFD[6]，对淋巴系统增殖非常重要，人类VEGFR3酪氨酸激酶结构域上的无义突变导致由于缺乏淋巴管的发育而发生家族性淋巴水肿综合征(Milroy disease)。新发现的神经纤毛蛋白1是一个独立的VEGFR，其与VEGF165特异性结合,可促进VEGF与VEGFR2的结合,发挥更有效的生物学作用。此外，尚存在可溶性VEGFR,研究得较多的是可溶性VEGFR1,它是由VEGFR1 mRNA不同剪接而产生的，仅有细胞外序列，其在哺乳动物、鸟类及两栖动物中都是保守存在的，所以推测和胚胎发育有关。

　　3 VEGFR的信号通路

　　VEGFR1和VEGFR2所引起的信号转导级联反应有所不同,这两种受体共同调节病理性和生理性血管的生成。VEGFR1扮演双重角色,在胚胎时期负性调节血管生成,而在成人却是正性调节酪氨酸激酶活性,可能与调节内皮细胞间作用、内皮细胞与基底膜作用以及内皮细胞的迁移相关。VEGFR2(KDR/Flk1)有强激酶活性，此受体激酶有效地激活内皮细胞中PLCγ(磷脂酶Cγ)和PKC通路以及其下游的cRafMEKMAP激酶通路[7]。另外，自磷酸化位点1175酪氨酸的信号，对于PLCγ的结合和激活PLCγPKC通路是至关重要的，此位点上酪氨酸突变为苯丙氨酸的小鼠(flk1 1173F/1173F小鼠)由于缺乏血管的发育导致胚胎死亡[8]。

　　VEGFR2产生很多的血管发生信号不仅仅是导致内皮细胞增殖，而且导致细胞迁徙及形态建成包括管状结构的形成。951酪氨酸结合接头蛋白TSAd从而调节细胞迁徙[9]。Nrp1是VEGFA165的联合受体，其与VEGFA165结合后可以增加VEGFA165结合VEGFR2的亲和力，并且增强了信号转导。对于VEGFR3的信号通路还没有完全的认识，报道较多的是PLCγPKC通路，Ras通路的激活也是有报道的，两条通路在信号活化中起同样作用还是其中某一条起主要作用还需要研究。

　　4 VEGF在肝癌中的表达及其意义

　　肿瘤生成和转移受诸多因素的影响和制约,血管形成是主要因素之一。肿瘤血管形成也是一个极为复杂的过程,涉及蛋白酶分解基底膜、内皮细胞迁移和增生及毛细血管网形成。在初始阶段,肿瘤细胞释放血管形成因子激活内皮细胞,同时产生蛋白酶使基底膜降解，促进内皮细胞增殖和迁移。另一方面，内皮细胞旁分泌某些生长因子刺激瘤细胞生长，内皮细胞和瘤细胞相互作用终形成毛细血管样结构。由于肿瘤诱发的血管不同于正常血管,其结构与功能异常，易引起局部坏死。另外，肿瘤组织微血管基底膜不完整，血管壁缺乏平滑肌支持，血管壁很薄，易通透，瘤细胞产生的各种因子和蛋白酶类易渗透至细胞间隙;而瘤细胞易穿透到血管内使瘤细胞顺血流到远端部位，形成微小转移灶。肿瘤组织诱导的血管生成是一复杂的多因素调节过程，已陆续发现多种血管生成因子，其中以VEGF的作用为突出。

　　4.1 VEGF在肝癌中的表达

　　VEGF与肿瘤的血管形成关系密切,并与肿瘤的复发、转移有关，在肝癌中也不例外。Brodsky等[10]使用免疫组化分析以及Westernblot的方法来研究正常肝组织、肝硬化和肝癌中VEGF表达和血管密度的关系，发现与正常肝组织比较，肝癌组织中的血管密度是增高的(185%)，并且在血管密度和VEGF表达之间有明显的关联(r=0.98,R2=0.969 6)。说明了VEGF与肝癌的发生、发展密切相关。

　　4.2 肝癌中VEGF的生成

　　VEGF的生成受多种因素的影响，其中可以上调其表达的有缺氧、雌激素等，主要的因素是缺氧。缺氧通过两种机制影响VEGF的合成：(1)缺氧可以导致HIF1升高，而HIF1是缺氧诱导肿瘤组织VEGF高表达的主要因素，可以导致VEGF转录水平的提高和VEGF mRNA稳定性的增强[11]。(2)在缺氧状态下，bcl2表达显著上调，增强了VEGF mRNA的稳定性，bcl2通过HIFl转录因子增强了VEGF启动子的活性，从而诱导VEGF高表达[1213]。另有研究显示缺氧使得HIFα蛋白避免了被泛素蛋白降解，HIFα可以诱导肿瘤组织中VEGF生成[14]，而肿瘤自分泌的转化生长因子可刺激肿瘤周围组织细胞以旁分泌的形式分泌VEGF。此外，某些细胞因子和生长因子如白细胞介素(IL)1β、IL6、干扰素(IFN)α、IFNγ、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等均有协同作用，可加强肝癌细胞中VEGF的表达。一些癌基因和抑癌基因的突变也可使VEGF表达增加。

　　4.3 肝癌中VEGF/VEGFR的类型

　　肝癌组织中VEGF的表达主要是VEGF121和VEGF165。蒋扬富等[15]通过逆转录聚合酶链反应(RTPCR)研究发现，在肝癌、肝硬化和正常肝组织中均以VEGF165表达为主。Yasuda等[16]利用免疫组化的方法对28例肝癌组织标本研究后认为，在肝癌组织中VEGFR的表达以KDR/flk1为主。LeCouter等[17]认为肝癌血管中的内皮细胞表达VEGFR1和VEGFR2，并且可以形成互相刺激的循环。

　　4.4 肝癌中VEGF的分泌形式

　　An等[18]研究发现,VEGFR在肝癌细胞和肝癌组织中的内皮细胞表面均有表达,表达水平为正常肝组织的7倍;并发现肝癌病例的非癌组织和肝癌组织中、转移性肝癌病例的非癌组织和肝癌组织中均有VEGF的表达，提示了VEGF的旁分泌机制。但是近越来越多的证据显示，肿瘤中可能存在VEGF的自分泌机制，即肿瘤细胞分泌的VEGF在作用于血管内皮细胞调节肿瘤血管形成的同时，也作用于肿瘤细胞自身，通过某种机制调节肿瘤细胞的分裂增殖。VEGF必须通过其特异性受体才能发挥生物学功能，自分泌途径也不例外。在人类卵巢癌、黑色素瘤、血管瘤、艾滋病卡氏肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤以及膀胱肿瘤中相继发现，不仅肿瘤血管内皮细胞有VEGFR的表达，瘤细胞中也有Flt1和KDR的表达(其中多数肿瘤细胞以表达KDR为主)，这是肿瘤中VEGF自分泌机制存在的物质基础。

　　艾军华等[19]使用RTPCR方法研究发现，肝癌细胞株MHCC97H、MHCC97L和SMMC7721都有VEGFR1 mRNA表达，且高转移潜能的MHCC97H表达强，3种肝癌细胞株中转移潜能低的SMMC7721表达弱，而在肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02未检测到VEGFR1 mRNA的表达。在检测的4种肝癌细胞株和L02中都有VEGFB mRNA表达。使用Westernblot方法研究MHCC97H、MHCC97L、SMMC7721和HepG2 4种细胞株发现都有VEGFB的表达;使用ELISA方法研究发现，4种肝癌细胞株的培养上清液中均能检测到VEGFA，从而证明了肝癌细胞可以通过自分泌机制产生VEGF。

　　4.5 VEGF对于肝癌的临床意义

　　手术切除被认为是肝癌治疗的方法，但肝癌早期诊断率低，一般发现都是晚期，手术切除率低，并且术后转移和复发是影响患者术后长期生存的首要原因。因此，早期诊断和早期判断复发是治疗的关键。

　　Kamel等[20]在比较肝癌、肝纤维化患者治疗前与健康者血浆VEGF和MMP9水平时发现，有门静脉侵犯和转移的肝癌患者其血浆VEGF、MMP9水平较无门静脉侵犯和转移的明显升高，并且发现血浆VEGF水平在肿瘤>5 cm和<5 cm的患者之间存在明显差异，但是MMP9却不随肿瘤的大小而变化。因此，肝癌患者治疗前血浆VEGF、MMP9水平可能是肝癌血管侵袭和转移的潜在标志物，血浆VEGF可以作为肿瘤大小的一个分子标志物。Yao等[21]的研究显示肝癌患者血中VEGF水平也增高，正常人，肝炎、肝硬化和肝癌患者血VEGF的水平依次增加，肝癌组与其他组有明显差异，而对照组与肝炎组和肝硬化组却无显著性差异，且血浆VEGF的水平是确定肝转移的有效指标，其特异性、敏感性和准确性均高。

　　VEGF mRNA表达肝癌组织明显高于癌旁组织，且与肝癌发生关系密切，因此可以用于肝癌的临床诊断和预后判断。Sheen等[22]通过RTPCR对肝癌术后切除的非癌性肝组织中VEGF mRNA进行检测后认为,非癌性残余肝组织中VEGF165的高表达可以作为术后复发的预测指标,且能反映复发的恶性程度,而VEGF121则不能。

　　VEGF表达水平反映肝癌生长速度和转移倾向，但更确切的关系有待研究。针对VEGF及其受体的抗血管治疗已经从实验走向临床。苏拉明可选择性地结合亲肝素血管生长因子，抑制VEGF与受体结合，达到抑制VEGF诱导血管内皮细胞增殖的目的。

　　5 展 望

　　VEGF的研究加深了对肝癌血管生成的认识，随着对VEGF研究的不断深入，人们对肝细胞肝癌的发生、发展以及治疗将会有更深的认识。在各种良性肝病患者中进行VEGF或某些基因结构和功能改变的监测，有助于筛选肝癌的高危患者，在细胞学病变出现之前阻断或逆转癌前病变向肝癌的发展，可以达到肝癌早期防治的目的。对于患有肝癌的患者可以使用激酶抑制剂或者是VEGFR的单克隆抗体，有目的地干扰VEGF的信号传导通路，抑制肿瘤血管生成。在肿瘤的基因治疗中,可利用VEGF将毒素和药物或外源基因靶向性导入VEGF受体阳性的细胞，通过抑制肿瘤血管生成终达到抑制肿瘤生长的目的。以上这些都将是以后的研究重点。

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