HLA-DRB1高分辨测序分型与48例非亲缘性脐血移植者GVHD相关性分析

作者：杨昕,廖灿,李焱,黄以宁,许遵鹏　　作者单位：广州市妇婴医院广州脐血库，广州 510180

　　【摘要】1998年6月至2003年7月，广州脐血库向国内21家移植中心提供非亲缘异基因脐血移植54例。本研究采用PCR产物直接测序法对HLA-DRB1进行高分辨分型(PCR-sequencing ba[x]sed typing PCR-SBT)，并结合HLA-SSP低分辨分型结果，探讨非亲缘性脐血移植供/受者HLA-DRB1等位基因及其亚型与脐血移植GVHD发生率的关系。利用盐析或柱提法提取48例非亲缘性脐血及移植患者全血DNA，采用HLA-SBT方法分别对HLA-DRB1等位基因进行高分辨分型，并与HLA-SSP(HLA-sequencing specific primers)低分辨结果进行比较分析。结果表明：采用双盲法对48例非亲缘性脐血移植供/受者样本HLA-DRB1进行高分辨分型，结果HLA-DRB1等位基因亚型匹配全相合病例的GVHD发生率(25%)显著低于不完全相合病例的GVHD发生率(65.6%)(P=0.008)。结论：对HLA-DRB1采用高分辨分型方法在非亲缘性脐血移植HLA分型方面具有重要的临床应用价值。

　　【关键词】 非亲缘性脐血移植

　　Abstract Unrelated umbilical cord blood units for 54 cases in 21 transplant centers were provided by Guangzhou Cord Blood Bank in China from 1998 to 2003. This study was aimed to identify HLA-DRB1 alleles by means of PCR sequencing ba[x]sed typing methods (SBT) and to analyze the correlation between HLA-DRB1 alleles and GVHD in unrelated umbilical cord blood transplantation (UCBT). 48 out of 54 patients received UCBT were followed up. DNA were extracted from cryopreservation blood of recipients/donors with UCBT，HLA-DRB1 alleles typing were done by SBT. Compared with low resolution results of HLA-DRB1 alleles，high resolution results were analyzed to see any correlation between HLA-DRB1 alleles and GVHD. by double-blind statistically analysis of HLA-DRB1 high resolution in 48 donor/recipient typings in UCBT. The results showed that the incidence of GVHD (25%) in patients who has HLA-DRB1 alleles matched with donors significantly lower (65.6%) than that in the patients with HLA-DRB1 alleles mismatched (P=0.008). It is concluded that HLA-DRB1 by high resolution typing method is important in clinical application in UCBT.

　　Key words unrelated umbilical cord blood transplantation;HLA-DRB1 allele;GVHD

　　HLA高分辨分型方法的建立，进一步揭示了异基因造血干胞移植与HLA等位基因的关系。有研究表明，HLA-DRB1等位基因不同与GVHD之间存在强相关性，而且DRB1不相合与存活期缩短密切相关[1]。但是，现在的研究表明并不是所有等位基因不同与它的不相容是一致的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的[2，3]。因此，采用HLA高分辨分型对移植供受体进行回顾性研究，不仅可以对HLA血清学分型起到积极的校正作用，而且对研究哪些HLA等位基因相合可以明显减弱GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及制定相对个体化的HLA分型策略都具有重要的临床应用价值。

　　本研究采用以测序为基础的HLA分型技术(HLA-sequencing ba[x]sed typing HLA-SBT)对可随访的48例脐血移植病例HLA-DRB1分型进行了回顾型分析，以查明HLA低高分辨分型情况下的匹配程度与GVHD的相关性，初步探讨了HLA-DRB1等位基因匹配程度对非亲缘脐血移植GVHD的影响。

　　材料和方法

　　研究对象选择

　　脐血来源 捐赠的脐血全部来自广州市妇婴医院产科。这些脐血于第三产程采集，脐血的分离、冷冻、保存以及相关的检测详见文献〖2]。

　　移植供受体选择 来自21家移植中心共74例非亲缘性脐血移植病例，剔除多份脐血移植病例13例，无法统计分析病例7例及待随访病例6例，选择48例非亲缘性脐血移植供受者进行统计分析。移植受者一般情况、疾病状态以及移植后随访资料由各个移植中心提供(表1)。Table 1. Incidence of diseases in 48 UCBT recipients (略)

　　实验方法

　　移植供/受体DNA提取 均采用G&T DNA提取试剂盒进行提取。

　　HLA-SSP分型 采用One Lambda公司的HLA-SSP分型试剂盒进行分型。HLA-SBT方法 采用ABI PRISM3100型测序仪进行分析。①PCR扩增：DNA 4 μl与PCR Mix(Forensic公司提供)16 μl混合，再加入Gold酶0.3 μl进行扩增反应。PCR条件如下：95℃ 10分钟;96℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 3分钟，36个循环;保存在4℃;②消化：向PCR产物中加入3 μl Exo SAP-IT，进行消化反应：37℃ 20分钟，80℃ 15分钟;③测序反应：消化后产物Sequencing Mix 混合后，进行测序反应：96℃ 20秒，60℃ 2分钟，25个循环。测序反应产物用NaOAc/EDTA去除多余的Sequencing Mix，并用及80% EtOH沉淀和纯化DNA;④电泳：加入15 μl甲酰胺，置于ABT Prism 3100测序仪中进行电泳;⑤结果分析：利用MatchTools及MT Navigator软件对电泳结果进行分析，得出HLA高分辨配型结果。

　　数据统计

　　采用SPSS 10.0统计软件包和Chi-square test分析。

　　结 果

　　非亲缘性脐血移植供/受者HLA分型方法相合性

　　48例非亲缘性脐血移植供、受者HLA采用PCR-SBT技术在低分辨水平(HLA基因型星号后2位数)与SSP分型结果相符，HLA-DRB1等位基因全相合38例(79.2%)，不全相合10例(20.8%)。采用HLA-SBT高分辨率分型结果提示：HLA-DRB1等位基因亚型全相合16例(33.3%)，1/2位点相合25例(52.1%)，2/2位点相合7例(14.6%)。

　　SBT分型结果与GVHD发生率

　　48例非亲缘性脐血移植供受者中，GVHD发生25例(52.08%)。对以上48例非亲缘性脐血移植供/受者HLA-DRB1等位基因亚型分析结果表明，16例HLA-DRB1等位基因亚型全相合病例中，GVHD发生4例(25%);32例HLA-DRB1等位基因亚型不完全相合中，GVHD发生21例(65.6%)，其中25例HLA-DRB1等位基因亚型1/2位点不相合病例中，GVHD发生16例(64%);7例HLA-DRB1等位基因亚型完全不相合的病例中，5例发生了GVHD(71.4%)。统计分析显示，48例非亲缘性脐血移植HLA-DRB1等位基因亚型相合与不完全相合和完全不相合受者GVHD发生率具有显著的统计学差异(P=0.008)(表2)。Table 2. HLA matching and occurrence of GVHD in 48 cases received unrelated UCBT(略)

　　多因素分析

　　根据48例非亲缘脐血移植随访资料，将年龄，体重，有核细胞输入量(TNC输入量)，CD34+细胞输入量，GM-CSF输入量，CMV感染及HLA-DRB1匹配情况等影响GVHD的多个因素进行Kruskal-Wallis 检验，发现患者年龄和HLA-DRB1等位基因匹配与否与GVHD发生率具有统计学相关性(年龄因素P=0.03，HLA-DRB1匹配因素P=0.009)，未发现其他因素与GVHD有显著相关性。对年龄因素及HLA-DRB1匹配情况进行Partial correlations分析，控制年龄因素后HLA-DRB1匹配情况同GVHD仍具有显著相关性(r=0.3731，P=0.01)。

　　讨 论

　　HLA高分辨分型方法的建立，进一步揭示了异基因造血干细胞移植与HLA等位基因的关系。有研究表明，单个等位基因的不匹配(如白种人HLA-A*0201和HLA-A*0205亚型)可以引起严重的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)[4]。也有报道，DRB1等位基因不同与GVHD之间存在强相关性，而且DRB1不合与存活期缩短密切相关[5]。但是现在的研究表明，并不是所有等位基因不同与它的不相容是一致的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的。在Nicholson等[6]对HLA-DP抗原的报道中，采用混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)方法观察到强烈的MLR反应与DPB1*0301和DPB1*0201有关，低MLR反应与DPB1*0401和DPB1*0402有关。因此，有必要找到哪些HLA等位基因不相合是移植病人可以耐受的，哪些HLA等位基因相合是必需的，使HLA在造血干细胞移植中的应用前景更广阔[7-10]。

　　本研究通过对广州脐血库近5年来48例非亲缘性脐血移植供受者HLA-DRB1等位基因结果进行等位基因亚型分析，认为HLA-DRB1等位基因亚型分型在脐血移植HLA分型方面具有一定的科研及临床应用价值。

　　在本研究结果中，HLA-DRB1等位基因亚型0/2、1/2和2/2位点不相合的患者GVHD发生率分别为25%(4/16)、64.0%(16/25)和71.4%(5/7)。通过单因素统计分析发现，HLA-DRB1匹配与否与GVHD发生率具有强相关性(P<0.01)。将HLA-DRB1匹配情况与年龄、体重、TNC输入量、CD34+细胞输入量，GM-CSF输入量，CMV感染等因素进行多因素统计分析，HLA-DRB1与GVHD仍具有显著相关性(r=0.3731，P=0.01)，说明HLA-DRB1分型采用高分辨方法可以明显减弱GVHD的发生率。

　　因此，在非亲缘性脐血移植HLA分型中，对HLA-DRB1位点采用HLA高分辨分型技术可以显著降低GVHD发生率。

　　致谢：感谢中山医科大学孙逸仙医院、广州市人民医院、广州市妇婴医院、北京大学人民医院、北京儿童医院、安徽省立医院、河南省肿瘤医院、南方医院、暨南大学华侨医院、第四军医大学西京医院、第二军医大学长海医院、广东省人民医院、四川大学华西医院、上海儿童医学中心、北北大学深圳医院、海口市人民医院、广州市第十二人民医院、佛山人民医院、广东省117医院给予的支持和协作。