慢性异体肾移植病人肾纤维化组织中MMP

　    作者：郭继华， 王俊， 孟伟， 师龙生， 张和平

　　【关键词】 慢性肾移植肾病,肾纤维化,MMP

　　摘要: 目的：探讨慢性异体肾移植病人肾纤维化组织中基质金属蛋白酶2(MMP2)、金属蛋白酶抑制物(TIMP1)、波形蛋白(Vimentin)和角蛋白(Keratin)的表达与肾纤维化间的关系。方法：收集我院18例肾移植后不同程度肾纤维化病人及10例正常肾组织，进行MMP2、TIMP1、Vimentin 及Keratin的免疫组化定量检测分析。结果：肾纤维化早期，与正常肾组织对比，抗MMP2和Keratin呈显较强免疫阳性反应，且量增加;随肾纤维化程度增加，抗MMP2和 Keratin免疫染色阳性反应减弱，量减少，甚至出现阴性;抗TIMP1和Vimentin免疫染色阳性增强，并随着纤维化进展而量增加。结论：由肾纤维化组织局部Vimentin阳性与相关细胞产生并分泌的细胞因子以诱导MMP2、TIMP1的活性改变在慢性肾移植肾病患者的肾纤维化过程中具有关键性作用。

　　Abstract: ob[x]jective: Renal fibrosis of patients with chronic allegraft nephropathy (CAN) usually progressed a fatal renal failure. To explore the pathogenic mechanism of renal fibrosis may provide more effective preventing and therapy means. Recently, some biomolecules playing very essential role in this lesions was reported. The histopathology and immunonisto chemistry detection were investigated in renal fibrosis specimens in present study. Methods: Renal fibrosis tissues with differnent degrees were collected from patients with CAN and 10 normal kidney specimens of nonnephropathy patients for investigation. AntiMMP2, AntiTIMP1, Antivimentin, and antiKeratin, monoclonal antibodies immunostaining and an image quantitative assessment was carried out by conventional means. Results: In the early staging of renal fibrosis, positive immunostaining of MMP2 and keratin revealed more strong and the volume increasing compared with normal renal specimmens. The degree of renal fibrosis increasing, a positive immunostaining of above two agents showed more weakly and volume declining even revealed negative. Meanwhile antiTIMP1 and vimentin immunostaining revealed a strong positive and the volume increasing associated with fibrosis progressing. Conclusion: The bioactivity of MMP2 and TIMP1 changes induced by some cytokines which produced and secreting from local vimentinpositive and related cells may play an important role in renal fibrosis of patients with CAN.

　　Key words: renal fibrosis; MMP2, TIMP1, vimentin, keratin; CAN; immunohistochemistry

　　肾移植手术挽救了很多因肾功衰竭而面临死亡威胁病人的生命，无疑是医学进步的巨大成果。然而，一些接受肾移植的病人，又出现肾功减退或肾衰。移植肾组织发生纤维化及肾单位不同程度毁损和消失，被认为是机体对移植肾的慢性排斥反应所致，也是肾移植病人长期存活的主要障碍。至今，肾纤维化发生、进展的关键环节和确切发病学机制并未完全阐明。肾组织内某些细胞因子及生物活性分子在这类病变的发生与进展过程具有重要作用[1,2]。为探索更有效防治本病的途径，本研究对本院近年出现移植肾纤维化的标本，采用免疫组化法对几种与纤维化密切相关的生物活性分子定量检测分析，现报道如下。

　　1资料与方法

　　1.1临床资料1992年2月~2005年2月共收集病理确诊的慢性肾移植肾病的肾脏切除标本18例，年龄18~55岁，平均32岁，男性13例，女性5例;汉族10例，维吾尔族4例，哈萨克族3例，其它少数民族1例。长时间为5年，短时间为7个月。将慢性排斥反应根据国际标准化的BANFF分类进行分级[3]：轻度3例，中度8例，重度7例。

　　1.2标本处理所有切除的肾组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，每例切4 μm厚切片5张，分别进行HE染色和免疫组化染色。免疫组化染色采用福建迈新试剂公司提供的抗基质金属蛋白酶(MMP2)、抗金属蛋白酶抑制物(TIMP1)、抗波形蛋白(Vimentin)和抗角蛋白(Keratin)的单克隆抗体，按SP法进行。

　　1.3结果判定光镜下MMP2、TIMP1、Vimentin和Keratin免疫阳性染色:分别在肾小球、肾小管、肾间质的细胞或/和细胞外基质出现程度不同的棕黄色颗粒。

　　1.4图像处理切片置于40倍物镜下测量标准测量光栏(226 459 μm2)中，对所测阳性区域进行定位后,由彩色摄像机提取图像,输入HPIAS1000图像分析仪测量系统,准确分割阳性区域[4] 后，测量MMP2、TIMP1和Keratin免疫染色阳性区域测量面积比,Vimentin测量该区域的单位灰度值。每张切片取上、下、左、右及中央5个视野进行定量检测。

　　1.5统计学处理应用SPSS软件对数据进行统计学分析，实验数据以±s表示，采用t检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　肾组织中MMP2、TIMP1、Vimentin和Keratin阳性免疫染色分布在肾间质、肾小管上皮、肾小球不同区域，呈棕黄色细颗粒状(图1、2、3)。肾纤维化的不同分期检测结果见表1。TIMP1和Vimentin，MMP2和Keratin检测结果与0期比较有统计学差异(P<0.01); 2期、3期与1期比较差异有统计学意义(P<0.01)。显示纤维化初期MMP2和Keratin反应增强，TIMP1活性低;随纤维化增加，MMP2与Keratin逐渐降低，而TIMP1与Vimentin却明显增强。

　　表1肾纤维化组织内MMP2、TIMP1、Keratin、Vimentin免疫阳性染色区定量检测情况(略)

　　注：与0期比较, *P<0.01; 与1期比较, △P<0.01

　　图1肾小管上皮MMP2呈阳性表达 (SP法×100)(略)

　　图2肾小管上皮细胞TIMP1呈阳性表达 (SP法×100)(略)

　　图3肾间质、肾小管、肾小球上Vimentin呈阳性表达 (SP法×100)(略)

　　3讨论

　　由于免疫抑制剂的合理应用与肾移植技术水平的提高，肾移植已成为挽救肾衰病人生命的重要手段。虽然近期效果已有显著的改善，但远期效果仍有待研究与提高。肾移植的平均半寿期仍徘徊在7~10年，这主要是因为慢性肾移植肾病所致[5]。研究表明,多种细胞因子在肾纤维化过程中起重要调控作用[2]。细胞外基质(extracellular matrix，EM)过度积聚，导致移植肾纤维化，是慢性肾移植肾病(chronic allogrft nephropathy,CAN)功能减退甚至完全丧失的重要病理变化。EM分两类，即胶原和非胶原蛋白类，大部分EM属胶原蛋白家族，包含许多由α链组成的不同类型。在肾脏中主要为Ⅰ型和Ⅲ型，它们均属纤维蛋白类。Ⅳ型胶原蛋白属非纤维蛋白类，为构成基膜的主要成分。在小管间质中含上述3种胶原成分，小球中主要含Ⅲ型和Ⅳ型胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原在间质中沉积为肾脏纤维化的新特征。EM 的合成和降解在生理状态下处于动态平衡中。病理情况下，基质合成增加，分解减少，导致EM积聚，产生纤维化[6]。

　　EM的降解涉及4种蛋白水解酶，其中重要的有金属蛋白酶(MMP)。它们大多由局部组织的细胞酶原形式分泌，经活化后几乎可以降解细胞外基质的所有成分[7~9]。MMP2是MMPs家族的成员，MMP2即72KD IV型胶原酶(又称明胶酶A),主要降解胶原的形成。Vimentin是中等纤维(Ⅲ型蛋白)的主要成分之一，在成纤维细胞中起到细胞支架与网络的作用[10]，也是间叶组织的重要标记分子。在肾纤维化初期，MMP2与Vimentin免疫反应强且量多，反映间质细胞增生与阻止细胞外基质沉积活性的并存。而TIMPs 是组织中MMPs主要内源性抑制因子，可与活性MMPs不可逆结合，抑制其对EM的降解活性，导致移植肾纤维化[11,12]。在正常肾脏中检测不到TIMP1，在肾纤维化动物模型中显示含量增加,并发现它与Ⅲ型蛋白表达上调相关。提示TIMP1对MMP2抑制可能是肾纤维化发生的重要原因。

　　近年来发现,肾纤维化过程转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGFβ1)与结缔生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)有促进MMP2分泌及肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、间质细胞及成纤维细胞表型转化的作用[2,12]，并产生出肌纤维细胞，降低MMP2的活性，致使EM沉积并使肾纤维化进展[13]。本研究也发现，随着纤维化进展， MMP2和Keratin免疫染色阳性减弱与量减少，或许反映了肾小管上皮细胞，肾小球内某些细胞成分的逐渐减少的趋势。杨梅等[13]用体外细胞培养与基因重组技术也发现，肾组织内纤维母细胞、肌纤维细胞在细胞因子(TGFβ1、CTGF)的作用下，确有调控肾纤维化过程某些重要环节的作用。

　　本研究结果显示，肾组织中MMP2纤维化1~3期与0期比较有统计学差异。随着肾纤维化的进展含量降低，提示EM的降解能力减弱。而TIMP1和Vimentin于3期免疫反应强，说明大量肾实质细胞毁损，促进EM积聚，而Keratin在肾纤维化过程的免疫反应改变正好反映了这种病变的特点。如能在临床肾移植后，定期检测肾组织内MMP2、 TIMP1、Vimentin，Keratin等免疫组化标记分子的变化，或许有利对病人移植肾功能状态的评估与预后判断，并及时发现和探索有效防治慢性移植肾纤维化发展的新途径。