急性髓细胞白血病FLT3ITD基因突变的检测及其临床意

     作者：尹列芬,王晔,姚锦,黄桂云,瞿晓媛　　作者单位：昆明医学院第二附属医院血液科，云南昆明 650101

　　【摘要】目的 探讨急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者人Fms样酪氨酸激酶3内部串联重复(Fmslike tyrosine kinase3intenal tandem duplication, FLT3ITD)基因突变及其临床意义。方法 采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chromatography, PCRDHPLC)方法检测60例初治AML患者和10例对照组骨髓FLT3ITD基因突变。结果 60例AML患者FLT3ITD突变阳性率21.67%(13/60)，10例对照组均未检测到该突变;FAB各亚型FLT3ITD突变率不同，有M3型突变率较高的趋势;FLT3ITD阳性组外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3ITD阴性组(P<0.01);FLT3ITD阳性组完全缓解(CR)率低于FLT3ITD阴性组(P<0.05)。结论 FLT3ITD基因突变多见于M3患者，FLT3ITD阳性者具有外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高、CR率低的特点。FLT3ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标。

　　【关键词】 急性髓细胞白血病;FLT3;内部串联重复;基因;聚合酶链反应变性高效液相色谱技术

　　Detection and clinical significance of FLT3 internal tandem

　　duplication mutation in acute myeloid leukemiaYIN Liefen, WANG Ye, YAO Jin, HUANG Guiyun, QU Xiaoyuan, YANG Ling

　　(Department of Hematology, the Second Affiliated Hospital of

　　Kunming Medical College, Kunming 650101, China)ABSTRACT: ob[x]jective To investigate the mutation of FLT3 internal tandem duplication (ITD) in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its clinical significance. Methods The mutation of FLT3ITD in bone marrow samples from 60 patients with de novo AML and 10 control groups was detected by polymerase chain reaction denaturinghigh performance liquid chromatography (PCRDHPLC). Results There were 13 out of 60 (21.67%) AML patients identified with FLT3ITD mutation, which was not identified in 10 of the control groups. Different FAB subtypes of AML had different mutation rate, and M3 had an obviously higher mutation rate than other subtypes. The peripheral white cell count and bone marrow blast cells were significantly higher in patients with FLT3ITD mutation than in those without (P<0.01). The complete remission rate was significantly lower in patients with FLT3ITD mutation than those without (P<0.05). Conclusion FLT3ITD mutation is likely to occur in M3 of AML patients. FLT3ITD mutation is associated with a higher peripheral white cell count and a higher percentage of bone marrow blast cells and a lower complete remission rate compared with those patients without FLT3ITD mutation. The detection of FLT3ITD mutation may be used as an index of AML prognosis.

　　KEY WORDS: acute myeloid leukemia; FLT3; internal tandem duplication; gene; polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography

　　人FLT3是Ⅲ型酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)家族成员的原癌基因，其蛋白产物属于受体，定位于细胞膜上。在正常人骨髓中，FLT3的表达仅限于CD34+干/祖细胞，该受体与多种胞浆蛋白作用介导一系列细胞内信号传导，诱导细胞增殖和分化。近来研究发现FLT3基因的异常表达、突变与急性白血病(acute leukemia, AL)的发生、发展、预后有密切关系[13]。酪氨酸激酶受体基因FLT3的内部串联重复序列(FLT3 internal tandem duplications, FLT3ITD)是一种FLT3的近膜区的突变，由NAKAO等[4]研究急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)时，于1996年首先报道。为探讨AML患者FLT3ITD的突变情况，我们采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chroma

　　tography, PCRDHPLC)技术检测60例初治AML患者骨髓FLT3ITD的突变情况并分析其临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 60例初治AML患者，诊断及疗效标准参照《血液病诊断及疗效标准》[5]。男27例，女33例，中位年龄48岁(18～79岁)。FAB分型为M0 3例，M1 3例，M2 14例，M3 13例，M4 13例，M5 12例，M6 2例，M7 0例。老年AML 30例(年龄>60岁)，非老年AML 30例，正常人及良性血液病患者为对照组共10例(3例健康人，5例缺铁性贫血患者，2例特发性血小板减少性紫癜患者)。

　　1.2 实验方法 采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(PCRDHPLC)方法。①DNA制备。取患者骨髓液2mL，应用美国Promega公司DNA提取试剂盒抽提总DNA。测定吸光度A260nm/A280nm值，确定DNA的纯度及浓度，并以去离子水稀释DNA样本为1g/L。②PCR扩增。应用Primer Express V2.0软件包以13号染色体外显子14、15设计引物，包括整个近膜区(JM)和激酶结构起始部分，扩增产物为329bp。引物由上海捷瑞公司合成，正义引物：5′GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC3′;反义引物：5′CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3′。PCR反应体系(50μL)：10×PCR缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 6μL，10mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L正/反义引物各2μL，模板DNA 4μL，Taq DNA酶0.5μL，双蒸水29.5μL。PCR条件：94℃，5min，1个循环;94℃，45s，56℃，45s，72℃，45s，共循环35次;72℃延伸10min，1个循环。③测序分析。部分变性DHPLC分析突变阳性产物：5μL预处理的PCR产物上样于Transgenomic公司的DNA sep分离柱，然后观察DHPLC图谱形态。发现异常的图谱形态PCR产物，纯化后测序(由大连宝生物生物公司帮助完成)，分析各FLT3ITD序列。

　　1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析。计量资料在作t检验、方差分析前先进行正态性、方差齐性检验，单变量两组资料采用t检验，方差不齐者采用非参数检验;计数资料采用卡方检验，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 AML患者FLT3/ITD基因突变的检测 60例初发AML患者，13例FLT3ITD突变阳性患者(21.67%)，其中M2 21.4%(3/14)，M3 30.8%(4/13)，M4 23.1%(3/13)，M5 25.0%(3/12)，M0、M1、M6、M7均未检测到该突变，有M3型突变率较高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。本实验检测的突变均为杂和突变，各例突变区域大小不等(6～100bp)，均为框内突变。10例对照组均未检测到突变。

　　2.2 FLT3ITD阳性AML患者临床特征 60例初治AML组中，13例FLT3ITD突变阳性，其中女8例(占25.0%)，男5例(占17.9%)，差异无统计学意义(P>0.05);30例老年AML组，8例 FLT3ITD突变阳性，突变阳性率26.7%，30例非老年AML组，5例FLT3ITD突变阳性，突变阳性率16.7%，二者相比差异有统计学意义(P<0.05)。FLT3ITD阳性AML患者的实验资料：FLT3ITD阳性组外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3ITD阴性组，均有统计学差异(P<0.01)(表1)。表1 AML患者FLT3ITD阳性者的临床特点

　　2.3 FLT3ITD阳性AML患者的疗效 采用DA(柔红霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷)方案治疗;M3维甲酸;13例FLT3ITD阳性AML患者6例获得CR(46.2%)，47例FLT3ITD阴性AML患者34例获得CR(72.3%)，二者相比差异有显著性(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　FLT3ITD突变是近年来AML中常见的突变类型之一。正常情况下，酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸激酶拮抗调节维持平衡的。如发生基因突变，将导致酪氨酸激酶持续活化，进而阻断对细胞的分化、增殖和凋亡调节功能，与肿瘤发生有密切关系。有研究表明[67]，约有19.2%～32.0%的AML患者存在有FLT3ITD突变，在成人新发AML的阳性率22.9%，在老年AML的阳性率为31.4%，在FAB亚型中，FLT3/ITD突变在M3的阳性率高，M5次之，M2、M6的阳性率较低。我们检测的结果显示，在AML中FLT3ITD突变阳性率为21.67%，其中M3高，M5次之。说明FLT3ITD突变在AML患者的疾病发生、发展中起一定作用，也提示FLT3ITD对于M3可能是一个预后不良的指标。

　　从临床资料分析，FLT3ITD有它独特的临床表现，男女无统计学意义;老年AML患者FLT3ITD突变阳性率高于非老年，二者有显著性差异，提示FLT3ITD突变可能与年龄有关，与老年AML的发生及预后存在密切关系，这与国内外报道相似[78]。我们的结果还显示，FLT3ITD突变阳性者具有外周血白细胞数高、骨髓白血病细胞比例多的临床特点，这与YANADA等[9]报道相似。我们的结果显示，FLT3ITD阳性AML患者CR率较FLT3ITD阴性AML患者低，二者有显著性差异。一方面说明FLT3ITD阳性AML患者对化疗不敏感，有抗药性，这与BANG等[10]报道一致，另一方面说明FLT3ITD阳性AML患者预后差。有作者对FLT3ITD重复序列的长度与预后的关系进行了研究，认为较长的重复序列与不良预后相关[11]，我们的结果显示，FLT3ITD阳性AML患者CR率较FLT3ITD阴性AML患者低,二者有显著性差异，FLT3ITD阳性AML患者外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3ITD阴性AML患者，这两个指标均提示预后差，说明FLT3ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标。